【摘要】：目的:慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是一個不可逆的疾病進展過程,最終發(fā)展為腎衰竭,進入終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)。CKD在兒童腎臟疾病中占大約1.2%,在腎臟疾病致死的患兒中,CKD致死率為9%。兒童一旦進入ESRD,會對其生長發(fā)育、心理健康等產(chǎn)生很大影響,生存質量降低,且ESRD死亡率極高。腎小管細胞的上皮-間質轉分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在CKD腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到了極為重要的作用。在眾多EMT的調節(jié)機制中,轉化生長因子beta(Transforming growth factor beta,TGF-β)信號途徑被認為是最主要的調節(jié)機制,而作為最主要的促纖維化因子,TGF-β在腎小管上皮細胞以及腎小球足細胞的EMT中扮演了非常重要的角色。P21活化蛋白激酶(p21-activated kinase,PAK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,進化保守,是Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42和Rac下游重要的靶蛋白。生長因子以及其細胞外信號能夠通過GTP酶和非GTP酶依賴的信號通路致PAKs活化,從而使PAKs參與細胞骨架、細胞生存、細胞有絲分裂和血管生成等生物學功能。目前研究發(fā)現(xiàn),PAKs家族共有6個成員,根據(jù)它們的結構特點以及相似性,分為兩大類,I類包括PAK1、PAK2和PAK3,II類包括PAK4、PAK5和PAK6。PAK4是II類PAKs中最早被報道的成員,大多數(shù)組織中都有表達,在前列腺、睪丸和結腸中表達水平較高。有研究顯示PAK4與腫瘤的EMT相關。本研究應用TGF-β1誘導人腎小管上皮細胞發(fā)生EMT時,探討PAK4在腎小管細胞上皮-間質轉分化中表達的變化以及PAK4在TGF-β1誘導的腎小管細胞上皮-間質轉分化中的作用及其機制方法:常規(guī)培養(yǎng)人腎小管上皮細胞(HK-2細胞),設定濃度梯度:分別給予0、l、2、5及10 ng/ml的TGF-β1刺激HK-2細胞48小時;設定時間梯度:均給予5ng/ml的TGF-β1刺激HK-2細胞0、12、24、48及72小時,在相差顯微鏡下觀察不同濃度及時間刺激對細胞形態(tài)的影響;應用Western blot、RT-PCR及免疫熒光方法檢測各組細胞的PAK4、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、纖粘連蛋白(Fibronectin)及波形蛋白(Vimentin)的蛋白表達水平及mRNA表達水平;應用Transwell小室法檢測不同濃度及時間刺激對HK-2細胞遷移能力的影響。根據(jù)基因序列設計特異引物,擴增PAK4基因片段,用慢病毒轉染法將Flag-PAK4轉染至HK-2細胞,構建過表達PAK4的穩(wěn)轉細胞系。慢病毒轉染5天后,應用Western blot檢測過表達PAK4的穩(wěn)轉細胞系是否構建成功。在過表達PAK4的穩(wěn)轉細胞系中,應用Western blot及RT-PCR檢測E-cadherin、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達,Transwell小室法檢測過表達PAK4后HK-2細胞遷移能力的變化。另外給予5ng/ml的TGF-β1刺激過表達PAK4穩(wěn)轉細胞系48h,應用相差顯微鏡觀察過表達PAK4的細胞形態(tài)變化,應用Western blot及RT-PCR檢測經(jīng)TGF-β1誘導各組的E-cadherin、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達,Transwell小室法檢測相應細胞遷移能力的變化。另外,設計了人PAK4靶向性shRNA,用慢病毒轉染法將shPAK4轉染至HK-2細胞,構建沉默PAK4的穩(wěn)轉細胞系。慢病毒轉染5天后,應用Western blot檢測過表達PAK4的穩(wěn)轉細胞系是否構建成功。在沉默PAK4的穩(wěn)轉細胞系中,應用Western blot、免疫熒光及RT-PCR檢測E-cadherin、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達,Transwell小室法檢測沉默PAK4對細胞遷移能力的變化。另外給予5ng/ml的TGF-β1誘導48h,應用Western blot、免疫熒光及RT-PCR檢測經(jīng)TGF-β1誘導各組的E-cadherin,、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達,Transwell小室法檢測細胞遷移能力的變化。應用Western blot方法檢測沉默PAK4后,細胞中β-catenin的變化,應用免疫熒光法檢測過表達PAK4穩(wěn)轉細胞系中β-catenin定位的變化結果:1.TGF-β1刺激HK-2細胞后,細胞呈梭形變,變細、變長,細胞間距增加,同一視野下細胞數(shù)量減少。2.TGF-β1以時間依賴和劑量依賴的方式下調HK-2細胞E-cadherin蛋白及mRNA表達,上調Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達,且最佳作用時間為48小時,最佳作用濃度是5 ng/ml。3.TGF-β1誘導HK-2細胞產(chǎn)生EMT時,PAK4表達增加,且隨著TGF-β1刺激時間的延長以及劑量的增加,PAK4蛋白表達增加,但mRNA表達水平無變化。4.隨著TGF-β1濃度增加,HK-2細胞的遷移能力增強。5.在HK-2細胞中通過慢病毒轉染法構建過表達PAK4及沉默PAK4的穩(wěn)轉細胞系成功。6.過表達PAK4后,細胞呈梭形變,變細、變長,細胞間距增加,同一視野下細胞數(shù)量減少。7.過表達PAK4后,E-cadherin蛋白及mRNA表達水平下降,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達水平增加。8.過表達PAK4后,HK-2細胞的遷移能力明顯增強,并且能夠與TGF-β1發(fā)揮協(xié)同作用,使HK-2細胞遷移能力進一步增強。9.過表達PAK4使TGF-β1誘導的E-cadherin的蛋白及mRNA表達水平進一步減少,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達水平進一步增加。10.沉默PAK4后,E-cadherin蛋白及mRNA表達水平上升,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達水平下降。11.沉默PAK4后,HK-2細胞的遷移能力減弱,并且能夠進一步減弱TGF-β1誘導的HK-2細胞的遷移。12.沉默PAK4使TGF-β1誘導的E-cadherin蛋白水平無明顯增高,但mRNA表達水平增加,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達水平減少。13.沉默PAK4使TGF-β1誘導的β-catenin蛋白表達減弱。14.免疫熒光可見過表達PAK4后,β-catenin蛋白定位發(fā)生變化,由細胞膜轉移到細胞核。結論:1.TGF-β1能誘導HK-2細胞產(chǎn)生EMT,與E-cadherin、Fibronectin及Vimentin存在劑量依賴性及時間依賴性,且隨著TGF-β1刺激濃度增加,HK-2細胞的遷移能力增強。2.TGF-β1誘導HK-2細胞發(fā)生EMT,PAK4也參與了該過程,且其蛋白表達水平與TGF-β1存在劑量依賴性和時間依賴性,但其mRNA水平無變化。3.PAK4能夠獨立誘導HK-2細胞發(fā)生EMT。4.過表達PAK4與TGF-β1協(xié)同誘導HK-2細胞發(fā)生EMT。5.沉默PAK4能夠抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞發(fā)生EMT。6.PAK4促進TGF-β1誘導的HK-2細胞發(fā)生EMT是通過激活β-catenin通路實現(xiàn)的
【圖文】：

TGF-β1 對 HK-2 細胞形態(tài)的影響TGF-β1 (5ng/ml)刺激 HK-2 細胞 72h 后，倒置顯微鏡觀察刺激前后的細胞形態(tài)變化(10X)。3.1.2 TGF-β1 對腎小管上皮細胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vimentin 蛋白及mRNA 表達的影響3.1.2.1 不同濃度 TGF-β1 對 HK-2 細胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vimentin蛋白及 mRNA 表達的影響Western blot 結果顯示，隨著 TGF-β1 刺激濃度增加，，HK-2 細胞 E-cadherin蛋白表達水平明顯下調，而 Fibronectin 及 Vimentin 蛋白表達水平逐漸上調, 與TGF-β1 呈劑量依賴性，見圖 2A。

TGF-β1 對 HK-2 細胞形態(tài)的影響TGF-β1 (5ng/ml)刺激 HK-2 細胞 72h 后，倒置顯微鏡觀察刺激前后的細化(10X)。2 TGF-β1 對腎小管上皮細胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vimentin 蛋NA 表達的影響3.1.2.1 不同濃度 TGF-β1 對 HK-2 細胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vim及 mRNA 表達的影響Western blot 結果顯示，隨著 TGF-β1 刺激濃度增加，HK-2 細胞 E-cad表達水平明顯下調，而 Fibronectin 及 Vimentin 蛋白表達水平逐漸上調-β1 呈劑量依賴性，見圖 2A。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R726.9

【參考文獻】

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本文編號：2647419