【摘要】：目的:慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是一個(gè)不可逆的疾病進(jìn)展過程,最終發(fā)展為腎衰竭,進(jìn)入終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)。CKD在兒童腎臟疾病中占大約1.2%,在腎臟疾病致死的患兒中,CKD致死率為9%。兒童一旦進(jìn)入ESRD,會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育、心理健康等產(chǎn)生很大影響,生存質(zhì)量降低,且ESRD死亡率極高。腎小管細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在CKD腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到了極為重要的作用。在眾多EMT的調(diào)節(jié)機(jī)制中,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta(Transforming growth factor beta,TGF-β)信號(hào)途徑被認(rèn)為是最主要的調(diào)節(jié)機(jī)制,而作為最主要的促纖維化因子,TGF-β在腎小管上皮細(xì)胞以及腎小球足細(xì)胞的EMT中扮演了非常重要的角色。P21活化蛋白激酶(p21-activated kinase,PAK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,進(jìn)化保守,是Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42和Rac下游重要的靶蛋白。生長(zhǎng)因子以及其細(xì)胞外信號(hào)能夠通過GTP酶和非GTP酶依賴的信號(hào)通路致PAKs活化,從而使PAKs參與細(xì)胞骨架、細(xì)胞生存、細(xì)胞有絲分裂和血管生成等生物學(xué)功能。目前研究發(fā)現(xiàn),PAKs家族共有6個(gè)成員,根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及相似性,分為兩大類,I類包括PAK1、PAK2和PAK3,II類包括PAK4、PAK5和PAK6。PAK4是II類PAKs中最早被報(bào)道的成員,大多數(shù)組織中都有表達(dá),在前列腺、睪丸和結(jié)腸中表達(dá)水平較高。有研究顯示PAK4與腫瘤的EMT相關(guān)。本研究應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí),探討PAK4在腎小管細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中表達(dá)的變化以及PAK4在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用及其機(jī)制方法:常規(guī)培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞),設(shè)定濃度梯度:分別給予0、l、2、5及10 ng/ml的TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞48小時(shí);設(shè)定時(shí)間梯度:均給予5ng/ml的TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞0、12、24、48及72小時(shí),在相差顯微鏡下觀察不同濃度及時(shí)間刺激對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響;應(yīng)用Western blot、RT-PCR及免疫熒光方法檢測(cè)各組細(xì)胞的PAK4、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、纖粘連蛋白(Fibronectin)及波形蛋白(Vimentin)的蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平;應(yīng)用Transwell小室法檢測(cè)不同濃度及時(shí)間刺激對(duì)HK-2細(xì)胞遷移能力的影響。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異引物,擴(kuò)增PAK4基因片段,用慢病毒轉(zhuǎn)染法將Flag-PAK4轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞,構(gòu)建過表達(dá)PAK4的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。慢病毒轉(zhuǎn)染5天后,應(yīng)用Western blot檢測(cè)過表達(dá)PAK4的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。在過表達(dá)PAK4的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中,應(yīng)用Western blot及RT-PCR檢測(cè)E-cadherin、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá),Transwell小室法檢測(cè)過表達(dá)PAK4后HK-2細(xì)胞遷移能力的變化。另外給予5ng/ml的TGF-β1刺激過表達(dá)PAK4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系48h,應(yīng)用相差顯微鏡觀察過表達(dá)PAK4的細(xì)胞形態(tài)變化,應(yīng)用Western blot及RT-PCR檢測(cè)經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)各組的E-cadherin、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá),Transwell小室法檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞遷移能力的變化。另外,設(shè)計(jì)了人PAK4靶向性shRNA,用慢病毒轉(zhuǎn)染法將shPAK4轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞,構(gòu)建沉默PAK4的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。慢病毒轉(zhuǎn)染5天后,應(yīng)用Western blot檢測(cè)過表達(dá)PAK4的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。在沉默PAK4的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中,應(yīng)用Western blot、免疫熒光及RT-PCR檢測(cè)E-cadherin、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá),Transwell小室法檢測(cè)沉默PAK4對(duì)細(xì)胞遷移能力的變化。另外給予5ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)48h,應(yīng)用Western blot、免疫熒光及RT-PCR檢測(cè)經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)各組的E-cadherin,、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá),Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)沉默PAK4后,細(xì)胞中β-catenin的變化,應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)過表達(dá)PAK4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中β-catenin定位的變化結(jié)果:1.TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞后,細(xì)胞呈梭形變,變細(xì)、變長(zhǎng),細(xì)胞間距增加,同一視野下細(xì)胞數(shù)量減少。2.TGF-β1以時(shí)間依賴和劑量依賴的方式下調(diào)HK-2細(xì)胞E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá),上調(diào)Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá),且最佳作用時(shí)間為48小時(shí),最佳作用濃度是5 ng/ml。3.TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生EMT時(shí),PAK4表達(dá)增加,且隨著TGF-β1刺激時(shí)間的延長(zhǎng)以及劑量的增加,PAK4蛋白表達(dá)增加,但mRNA表達(dá)水平無變化。4.隨著TGF-β1濃度增加,HK-2細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。5.在HK-2細(xì)胞中通過慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建過表達(dá)PAK4及沉默PAK4的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系成功。6.過表達(dá)PAK4后,細(xì)胞呈梭形變,變細(xì)、變長(zhǎng),細(xì)胞間距增加,同一視野下細(xì)胞數(shù)量減少。7.過表達(dá)PAK4后,E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)水平下降,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá)水平增加。8.過表達(dá)PAK4后,HK-2細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng),并且能夠與TGF-β1發(fā)揮協(xié)同作用,使HK-2細(xì)胞遷移能力進(jìn)一步增強(qiáng)。9.過表達(dá)PAK4使TGF-β1誘導(dǎo)的E-cadherin的蛋白及mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步減少,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步增加。10.沉默PAK4后,E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)水平上升,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá)水平下降。11.沉默PAK4后,HK-2細(xì)胞的遷移能力減弱,并且能夠進(jìn)一步減弱TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的遷移。12.沉默PAK4使TGF-β1誘導(dǎo)的E-cadherin蛋白水平無明顯增高,但mRNA表達(dá)水平增加,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá)水平減少。13.沉默PAK4使TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin蛋白表達(dá)減弱。14.免疫熒光可見過表達(dá)PAK4后,β-catenin蛋白定位發(fā)生變化,由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。結(jié)論:1.TGF-β1能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生EMT,與E-cadherin、Fibronectin及Vimentin存在劑量依賴性及時(shí)間依賴性,且隨著TGF-β1刺激濃度增加,HK-2細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。2.TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT,PAK4也參與了該過程,且其蛋白表達(dá)水平與TGF-β1存在劑量依賴性和時(shí)間依賴性,但其mRNA水平無變化。3.PAK4能夠獨(dú)立誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。4.過表達(dá)PAK4與TGF-β1協(xié)同誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。5.沉默PAK4能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。6.PAK4促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT是通過激活β-catenin通路實(shí)現(xiàn)的
【圖文】：

TGF-β1 對(duì) HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響TGF-β1 (5ng/ml)刺激 HK-2 細(xì)胞 72h 后，倒置顯微鏡觀察刺激前后的細(xì)胞形態(tài)變化(10X)。3.1.2 TGF-β1 對(duì)腎小管上皮細(xì)胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vimentin 蛋白及mRNA 表達(dá)的影響3.1.2.1 不同濃度 TGF-β1 對(duì) HK-2 細(xì)胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vimentin蛋白及 mRNA 表達(dá)的影響Western blot 結(jié)果顯示，隨著 TGF-β1 刺激濃度增加，，HK-2 細(xì)胞 E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，而 Fibronectin 及 Vimentin 蛋白表達(dá)水平逐漸上調(diào), 與TGF-β1 呈劑量依賴性，見圖 2A。

TGF-β1 對(duì) HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響TGF-β1 (5ng/ml)刺激 HK-2 細(xì)胞 72h 后，倒置顯微鏡觀察刺激前后的細(xì)化(10X)。2 TGF-β1 對(duì)腎小管上皮細(xì)胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vimentin 蛋NA 表達(dá)的影響3.1.2.1 不同濃度 TGF-β1 對(duì) HK-2 細(xì)胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vim及 mRNA 表達(dá)的影響Western blot 結(jié)果顯示，隨著 TGF-β1 刺激濃度增加，HK-2 細(xì)胞 E-cad表達(dá)水平明顯下調(diào)，而 Fibronectin 及 Vimentin 蛋白表達(dá)水平逐漸上調(diào)-β1 呈劑量依賴性，見圖 2A。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R726.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 閆U

本文編號(hào)：2647419