【摘要】：背景與目的 β-珠蛋白生成障礙性貧血(β-thalassemia,β-地貧)是一種常見(jiàn)的單基因遺傳病,對(duì)人類健康危害很大,是由于p-珠蛋白基因的缺失或缺陷使p-珠蛋白鏈合成減少,導(dǎo)致相對(duì)過(guò)剩的α-肽鏈形成包涵體沉積于細(xì)胞膜上,引起紅細(xì)胞變形能力下降,在脾臟內(nèi)被大量破壞所致的一組遺傳性溶血性疾病。目前p-地貧的根治方法只有骨髓移植,但由于配型的限制、實(shí)施中的風(fēng)險(xiǎn)、以及昂貴的費(fèi)用,在我國(guó)也只能用于極少數(shù)的重癥地貧患者。理論上基因矯正治療是最理想方案,但因珠蛋白基因的紅系組織特異性、發(fā)育階段特異性、表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性及基因矯正治療許多技術(shù)難題尚未解決,致使對(duì)基因矯正仍處于探索階段。多年來(lái)人們也致力于γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑的研究,即重新激活已近乎關(guān)閉的Y珠蛋白基因表達(dá),合成Y鏈以替代缺陷的p珠蛋白鏈與相對(duì)過(guò)剩的α鏈構(gòu)成胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin,HbF),降低α鏈與非α鏈之間的不平衡；或通過(guò)改變紅系細(xì)胞分化動(dòng)力學(xué)來(lái)增加仍保持γ珠蛋白基因表達(dá)能力的紅細(xì)胞群落,以達(dá)到減少溶血,緩解貧血癥狀的目的。 迄今為止,已發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)Y珠蛋白基因表達(dá)促進(jìn)胎兒血紅蛋白(HbF)生成的藥物主要有：(1)細(xì)胞毒素劑,如羥基尿(HU)、阿糖胞苷、長(zhǎng)春新堿、氨甲喋呤、順鉑及阿霉素衍生物等。(2)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltransferase,DNMT)抑制劑,如5-氮雜孢苷(5-AZAC)及地西臺(tái)賓等氮胞核苷類藥物。(3)組蛋白脫乙�；�(histone deacetylase, HDAC)抑制劑,如丁酸鹽類(butyrate)及其衍生物、apicidin等。其中HU和NaB是近年研究較多的兩種藥物,HU是一種細(xì)胞毒性γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑,是唯一通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療鐮狀細(xì)胞貧血的藥物,對(duì)輕型、中間型p地貧療效明顯,但對(duì)重型患者療效不穩(wěn)定,長(zhǎng)期使用存在致畸變、細(xì)胞毒性等毒副作用。丁酸鹽是一類組蛋白脫乙�；敢种苿�,對(duì)p-地貧有較好療效,但其血漿半衰期短(5～10分鐘),口服劑量大,且合成困難、價(jià)格昂貴,限制了臨床的廣泛應(yīng)用,因此迫切需要更有效且安全的新藥開(kāi)發(fā)及新的治療策略來(lái)解決這些問(wèn)題。新的化學(xué)藥物開(kāi)發(fā)花費(fèi)大且耗時(shí)長(zhǎng),而具有中國(guó)傳統(tǒng)特色的天然中藥不良反應(yīng)輕,藥源豐富,價(jià)格合適,具有良好的研究開(kāi)發(fā)前景,已有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸根素、白藜蘆醇等天然藥物提取物能有效上調(diào)Y珠蛋白基因表達(dá),但尚未用于臨床。在新藥開(kāi)發(fā)的同時(shí),聯(lián)合用藥治療成為研究藥物誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)的一個(gè)重要策略。聯(lián)合各藥物不同作用機(jī)制及靶點(diǎn),協(xié)同上調(diào)γ珠蛋白基因表達(dá),并降低用藥劑量減輕細(xì)胞毒性成為治療的關(guān)鍵；已有較多學(xué)者對(duì)HU與NaB、HU與EPO等聯(lián)合用藥進(jìn)行了研究,證明聯(lián)合用藥能協(xié)同誘導(dǎo)HbF生成,但由于實(shí)驗(yàn)對(duì)象、基因型、用藥劑量、樣本量等多方面因素導(dǎo)致研究結(jié)果不一致。目前研究較多的γ基因誘導(dǎo)劑多為細(xì)胞毒類藥,藥物聯(lián)合雖然可降低用藥劑量減輕細(xì)胞毒性,但p-地貧的治療是一個(gè)長(zhǎng)期的終生治療,其遠(yuǎn)期療效及毒副作用尚不確切,需繼續(xù)深入研究,尋找發(fā)現(xiàn)更有效且安全的治療方案。 我們通過(guò)中藥血清學(xué)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)從臨床上對(duì)p-珠蛋白生成障礙性貧血有治療效果的方劑中篩選出單味中藥黃芪,并且進(jìn)一步分離其有效成分,鑒定黃芪多糖(APS)是一種有效的γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用較小且作用持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、托毒排膿、利水消腫、斂瘡生肌等功能,毒理學(xué)研究也顯示黃芪毒性很低,急、慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)均未見(jiàn)明顯毒副作用,因此黃芪是一種安全性較高的中藥。APS具有刺激造血的作用,可以提高紅系集落形成單位(colony-forming unit-erythroid, CFU-E)和紅系爆式集落形成單位(burst formingunits-erythroid, BFU-E)的形成率,從而增加紅細(xì)胞數(shù)量與血紅蛋白量。APS在刺激骨髓造血、增強(qiáng)免疫功能及抗腫瘤方面的作用已得到學(xué)術(shù)界的普遍認(rèn)可。本課題組前期研究將APS與半衰期短、口服劑量大的NaB聯(lián)合,證實(shí)其能更有效誘導(dǎo)紅系分化,調(diào)節(jié)γ珠蛋白基因表達(dá),但γ珠蛋白基因的上調(diào)是否能夠使HbF表達(dá)增強(qiáng)尚未被證實(shí)。 本研究旨在探討黃芪多糖聯(lián)合丁酸鈉對(duì)K562細(xì)胞及人紅系細(xì)胞HbF合成的作用。首先以具有向紅系分化能力的人紅白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞為模型,通過(guò)聯(lián)苯胺染色實(shí)驗(yàn)觀察藥物誘導(dǎo)細(xì)胞紅系分化情況,再用比K562細(xì)胞更能模擬人體內(nèi)紅細(xì)胞生成過(guò)程的二步液體培養(yǎng)的人紅系細(xì)胞為模型,用Western blotting分析低劑量黃芪多糖、丁酸鈉聯(lián)合用藥對(duì)K562細(xì)胞及人紅系細(xì)胞HbF合成的作用,并用臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)觀察藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。研究結(jié)果將為研究誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)的聯(lián)合用藥增添新的科學(xué)數(shù)據(jù),為臨床聯(lián)合用藥方案及實(shí)施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1.材料來(lái)源 人紅白血病細(xì)胞系K562購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；臍血來(lái)源于南方醫(yī)院產(chǎn)科健康產(chǎn)婦分娩胎兒臍帶。 2.實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共包括5組:APS 2.5 mg/ml+NaB 250μmol/L為實(shí)驗(yàn)組,APS 2.5 mg/ml、NaB 250μmol/L為低劑量單藥組,NaB 500μmol/L為陽(yáng)性對(duì)照組,空白對(duì)照組為未加藥組。 3.K562細(xì)胞培養(yǎng)： K562細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng),培養(yǎng)于含10%胎牛血清,青霉素、鏈霉素各100U/mL,2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。 4.人紅系細(xì)胞二步液體培養(yǎng)： 從臍血中分離單個(gè)核細(xì)胞,分兩步在兩種不同的培養(yǎng)體系中進(jìn)行人紅系細(xì)胞的體外培養(yǎng),在第2階段的第6天按所需終濃度加藥,第14天結(jié)束培養(yǎng)。 5.臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)觀察藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響。 6.聯(lián)苯胺染色實(shí)驗(yàn)觀察APS、NaB聯(lián)合用藥誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化的程度。 7. Western blotting分析APS、NaB聯(lián)合用藥后K562細(xì)胞及人紅系細(xì)胞HbF表達(dá)水平。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性率比較采用析因分析；多組間均數(shù)比較采用One-way ANOVA,post hoc test方差齊性采用LSD法,方差不齊的采用DunnettT3法；P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1 APS、NaB聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 1.1 APS、NaB聯(lián)合用藥對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 APS 2.5mg/ml+NaB 250μmol/L作用K562細(xì)胞96h,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及細(xì)胞活力分別為(67.47±3.76)%和(91±1.3)%,與NaB500μmol/L組(88.86±1.53)%和(74±2.4)%比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 1.2 APS、NaB聯(lián)合用藥對(duì)人紅系細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 在培養(yǎng)第二階段d6加藥后,不同濃度的APS和NaB對(duì)人紅系細(xì)胞均存在不同程度的抑制作用(F=18.616,P=0.000)。隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),APS2.5mg/ml+NaB 250μmol/L組抑制率的峰值(36.84±1.27)%出現(xiàn)在用藥后第4天(即d10),小于NaB 5001μmol/L組(44.55±2.83)%(P0.05)。 2 APS、NaB聯(lián)合用藥對(duì)K562細(xì)胞紅系分化的作用 不同組別間聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性率(BZ%)有顯著差異(F=7185.879,P=0.000),低劑量聯(lián)藥組BZ%最高；用藥后不同時(shí)間點(diǎn)之間BZ%有顯著性差異(F=1519.977,P=0.000),72h及96h BZ%較高；不同用藥組在不同時(shí)間點(diǎn)的BZ%存在交互效應(yīng)(F=501.890,P=0.000),說(shuō)明不同用藥組的BZ%差異隨時(shí)間變化而變化,在96小時(shí)差異達(dá)到最大。APS2.5mg、NaB250μM聯(lián)合用藥可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化,于48-144小時(shí)BZ%增高顯著,96小時(shí)達(dá)高峰BZ%為(32.89±0.24)%,與常規(guī)劑量組NaB500μM(14.66±0.17)%比較增高有顯著意義(P0.05)；與單藥低劑量組APS2.5mg (7.72±0.12)%、NaB250μM (7.58±1.46)%比較均增高有顯著性意義(P0.05)。而常規(guī)劑量NaB組BZ%峰值在72h,并在96h以后急劇下降。 3 APS、NaB聯(lián)合用藥對(duì)K562細(xì)胞HbF合成的作用 APS 2.5mg/ml+NaB 250μmol/L、NaB 500μmol/L分別誘導(dǎo)K562細(xì)胞72h及96h,HbF合成均增強(qiáng)(F=31.181,P=0.010；F=32.845,P=0.009),分別增加至未加藥組的(1.69±0.14)、(1.67±0.10)倍和(1.82±0.16)、(1.57±0.08)倍,誘導(dǎo)前后差別有顯著性意義(P0.05)。低劑量聯(lián)藥組HbF表達(dá)水平較常規(guī)劑量NaB組稍高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4 APS、NaB聯(lián)合用藥對(duì)人紅系細(xì)胞HbF合成的作用 APS 2.5mg/ml+NaB 250μmol/L、NaB 500μmol/L分別誘導(dǎo)人紅系細(xì)胞12天,HbF合成增強(qiáng)(F=34.674,P=0.008),分別增加至未加藥組的(1.964±0.18)和(1.78±0.10)倍,誘導(dǎo)前后差別有顯著性意義(P0.05)。低劑量聯(lián)藥組HbF表達(dá)水平較常規(guī)劑量NaB組稍高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.實(shí)驗(yàn)證實(shí)低劑量APS、NaB聯(lián)合用藥能使K562細(xì)胞HbF合成增強(qiáng),與常規(guī)劑量NaB單藥作用相同。 2.實(shí)驗(yàn)證實(shí)低劑量APS、NaB聯(lián)合用藥能使人紅系細(xì)胞HbF合成增強(qiáng),與常規(guī)劑量NaB單藥作用相同。 3.進(jìn)一步證實(shí)APS+NaB低劑量聯(lián)合用藥比NaB常規(guī)劑量單獨(dú)用藥能更有效誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化。 4.低劑量APS、NaB聯(lián)合用藥誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化作用持續(xù)時(shí)間較常規(guī)劑量NaB組持久。 5.與常規(guī)劑量NaB單藥組相比,低劑量APS、NaB聯(lián)合用藥減輕了細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞毒性。 6.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床低劑量聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R725.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2647594