【摘要】：人類呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病毒病原之一，同時(shí)也是免疫抑制或缺陷的成人和老年人呼吸道感染的重要病原。鑒于RSV感染危害嚴(yán)重且無特異有效的治療方法和疫苗，1994年WHO已將RSV疫苗的研制列為全球疫苗計(jì)劃的優(yōu)先發(fā)展項(xiàng)目之一。 RSV融合蛋白(Fusion protein，F(xiàn)蛋白)是RSV病毒主要的保護(hù)性抗原，并且在RSV A、B兩型間相對保守，可以誘生抗野生型RSV感染的中和抗體。其中190～289位氨基酸含有2個(gè)重要的抗原表位區(qū)，能夠被大部分F蛋白特異性單克隆抗體所識別，并且這段氨基酸序列形成的構(gòu)象也滿足了中和表位的要求，這些都為真核表達(dá)提供了合理依據(jù)。 腺病毒載體是可經(jīng)粘膜免疫的理想載體，，目前已廣泛應(yīng)用于人類疾病的基因治療，重組疫苗及外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。本研究首先在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)RSV(A2株)病毒，從病變細(xì)胞中提取了病毒RNA。根據(jù)Gene Bank中RSV核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，并在上游引物的5’端分別加入Kpn Ⅰ酶切位點(diǎn)和Kozak片段；下游引物的5’端添加Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)和終止密碼子TAG。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-Polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)特異性擴(kuò)增出F基因片段(559～867位堿基)，TA克隆后經(jīng)雙酶切、PCR等方法篩選重組質(zhì)粒，序列分析證實(shí)插入序列編碼框正確后，再經(jīng)雙酶切、連接等分子生物學(xué)手段構(gòu)建含有目的基因的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV／F。通過電轉(zhuǎn)化法將經(jīng)PmeⅠ酶切線性化的pShuttle-CMV／F和對照質(zhì)粒pShuttle-CMV-lacZ轉(zhuǎn)入含有pAdEasy-1骨架質(zhì)粒的BJ5183-AD-1感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)鑒定同源重組成功的克隆，命名為重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy／F和pAdEasy／lacZ。接著，將二者分別轉(zhuǎn)化XL-10 Gold超感受態(tài)細(xì)菌獲得高拷貝重組腺病毒質(zhì)粒。大量提取重組腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)Pac Ⅰ酶切回收后定量。運(yùn)用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，48～72小時(shí)內(nèi)將對照組X-Gal原位染色檢測轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)組于37℃繼續(xù)培養(yǎng)，7～10天后出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，成功獲得了非復(fù)制型重組腺病毒rAd／F。收集病變細(xì)胞，在透射電鏡下觀察重組病毒具有典型的二十面體形態(tài)，直徑約70nm。PCR結(jié)果表明
【圖文】：

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圖1一4穿梭載體和骨架載體同源重組示意圖1一4HomologoL一5reeombinationbetweentheshuttleveetorandPAdEasy一1ve
【學(xué)位授予單位】：北京生物制品研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R373;R725.6

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本文編號：2646628