發(fā)布時(shí)間：2020-04-25 16:16

【摘要】：目的:支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早產(chǎn)兒最常見的呼吸系統(tǒng)疾病,目前發(fā)病機(jī)制尚不明確。新型BPD的主要病理改變是肺泡結(jié)構(gòu)簡單化和肺血管發(fā)育不良�，F(xiàn)有的研究已證實(shí),肺泡二型細(xì)胞的損傷和修復(fù)失衡是導(dǎo)致BPD肺發(fā)育障礙的關(guān)鍵�；虻倪z傳易感性和炎癥、氧化應(yīng)激、機(jī)械通氣、早產(chǎn)等多種環(huán)境因素相互作用最終可導(dǎo)致肺泡二型上皮細(xì)胞的損傷。損傷的肺泡二型上皮細(xì)胞出現(xiàn)增殖/凋亡失調(diào),轉(zhuǎn)化障礙甚至壞死,嚴(yán)重影響正常的肺發(fā)育進(jìn)程,最終導(dǎo)致BPD的發(fā)生。因此探索BPD的可能發(fā)病機(jī)制和藥物防治有著重大的科研價(jià)值和臨床意義。炎癥在BPD早期和進(jìn)展中發(fā)揮的作用已被公認(rèn),大量研究表明,BPD患兒的BALF(Bronchoalveolar Lavage fluid)和血清中的炎癥因子表達(dá)明顯增加,包括IL-1β,IL-6,IL-8,IL-18和TNF-α等。炎癥因子的釋放能激活固有免疫反應(yīng),產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng),進(jìn)一步調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子的分泌,導(dǎo)致肺泡二型上皮細(xì)胞損傷與修復(fù)失衡,最終形成BPD。以往的研究多局限于炎癥因子的表達(dá),而IL-1β和IL-18的成熟和分泌與炎性小體的關(guān)系密不可分。炎性小體(inflammasome)由胞漿內(nèi)模式識別受體(Cytoplasmic internal pattern recognition receptors,PRRs)參與組裝,是一種多蛋白復(fù)合物,參與固有免疫,在感受和識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)或者來自于宿主的危險(xiǎn)信號分子模式(Damage associated molecular patterns,DAMPs)后,招募和激活蛋白酶Caspase-1,活化的caspase-1片段對IL-1β和IL-18的前體進(jìn)行切割,產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18,促進(jìn)炎癥反應(yīng)。多種炎癥小體中NLRP3的作用最為廣泛,參與多種慢性炎癥性疾病。有研究報(bào)道,NLRP3敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠在高氧誘導(dǎo)下的肺發(fā)育形態(tài)明顯優(yōu)于野生型,這提示NLRP3是影響B(tài)PD肺發(fā)育的關(guān)鍵因子之一。多種因素參與調(diào)控NLRP3,部分研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控NLRP3,但這種調(diào)控是否起主要作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。咖啡因作為甲基黃嘌呤類藥物,因?yàn)樗幮Ш?安全性高,半衰期長等特點(diǎn),既往用于早產(chǎn)兒呼吸暫停的防治,而大量的臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn),使用咖啡因的早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生率明顯低于未使用咖啡因組,這闡明咖啡因?qū)PD很好的預(yù)防作用,且已經(jīng)在臨床常規(guī)應(yīng)用于早產(chǎn)兒。部分學(xué)者在BPD動物模型中也驗(yàn)證了咖啡因?qū)ξ闯墒旆闻K的保護(hù)作用。但是咖啡因通過何種途徑對未成熟肺臟發(fā)育過程進(jìn)行保護(hù),目前機(jī)制尚不明確。既往的研究闡明,咖啡因組的早產(chǎn)兒血清和BALF中IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子均顯著低于對照組,這提示咖啡因有良好的抗炎作用。因此,本研究在以往建立BPD新生鼠模型基礎(chǔ)上,試圖從肺形態(tài)學(xué)、肺血管發(fā)育、肺生長因子、肺增殖凋亡水平等多角度證實(shí)咖啡因?qū)PD未成熟肺的保護(hù)作用,同時(shí)通過mRNA和蛋白測定,探討咖啡因是否通過抑制NF-κB活性下調(diào)NLRP3并抑制其功能,從而為BPD的臨床治療提供更好的靶點(diǎn)。方法:建立BPD新生鼠動物模型,隨機(jī)分為4組:N組:空氣+生理鹽水,NC組:空氣+咖啡因,H組:模型+生理鹽水,HC組:模型+咖啡因,HC和NC組于新生鼠第1天給予咖啡因腹腔注射20mg/kg日1次持續(xù)至21天,安慰劑組給予等量生理鹽水;模型建立參考既往的造模方法,新生鼠于生后6小時(shí)內(nèi)放入氧箱,持續(xù)吸入80-85%的氧氣,空氣組吸入氧濃度為21%;模型建立第14天各取15只鼠處死,取肺臟,并將剩余H組和HC組的實(shí)驗(yàn)對象轉(zhuǎn)至空氣中繼續(xù)飼養(yǎng),至21天每組動物均處死取肺臟。取右肺下葉置于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,用于蘇木素伊紅(HE)染色和免疫組化染色,右肺上葉用于肺濕/干重比值的測量,左肺和剩余右肺凍存于-80℃,用于Real-time PCR和Western blot檢測。測定肺濕/干比值,計(jì)算RAC值和MLI,通過Weigert染色觀察彈性纖維表達(dá)和沉積,CD31免疫組織化學(xué)染色評價(jià)肺微血管發(fā)育,Western blot測定生長因子TGF-β1和PDGF的表達(dá)以及凋亡蛋白cleaved caspase-3和增殖蛋白PCNA的表達(dá),以上多角度綜合論證咖啡因?qū)Ψ闻K的保護(hù)作用。應(yīng)用免疫組化染色闡明肺組織NLRP3的定位和表達(dá),Western Blot和Real-time PCR方法檢測NLRP3、caspase-1 p10、IL-1β和IL-18蛋白和mRNA表達(dá)水平,相關(guān)性分析驗(yàn)證NLRP3相對蛋白表達(dá)水平和IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。通過Western Blot檢測pNF-κB和p IκBα的蛋白表達(dá)水平,并通過相關(guān)性分析證實(shí)pNF-κB的蛋白表達(dá)水平和NLRP3的蛋白水平的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示,應(yīng)用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間數(shù)值的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析,相關(guān)性分析采用Pearson分析,p0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.肺濕/干比值(W/D)比值測量發(fā)現(xiàn),H組在14天和21天的W/D比值明顯高于其他3組,HC組低于H組,但仍高于N組和NC組,提示咖啡因能減輕BPD的肺水腫;2.H組RAC值明顯下降,MLI明顯升高,較其他3組有顯著差異,提示肺泡結(jié)構(gòu)簡單化,HC組的RAC值高于H組,MLI值低于H組,于14和21天均有顯著差異,但較N組和NC組仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;3.彈性纖維染色提示:N組和NC組的彈性纖維主要沉積在肺泡的次級分隔頂端和支氣管壁,H組的彈性纖維在次級分隔沉積明顯減少,HC組的彈力纖維沉積較H組好轉(zhuǎn);4.CD31免疫組化染色發(fā)現(xiàn),H組的CD31染色面積明顯低于其他3組,14天和21天均有顯著差異,HC組的CD31染色面積高于H組,低于N組和NC組;5.H組cleaved caspase-3蛋白水平明顯高于其他組,而PCNA蛋白水平明顯低于其他組,HC組的cleaved caspase-3和PCNA的蛋白表達(dá)水平與N組和NC組無差異;6.H組生長因子TGF-β1和PDGF蛋白水平高于其他3組;HC組TGF-β1蛋白低于H組,高于N和NC組,PDGF蛋白表達(dá)僅低于H組,與N組和NC組無差異;7.NLRP3免疫組化提示,H組NLRP3表達(dá)明顯高于其他3組,主要在肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的核周腔表達(dá),HC組與N組和NC組表達(dá)無差異;8.Western blot結(jié)果表明,H組NLRP3蛋白和caspase-1 p10、IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)高于其他3組,HC組各指標(biāo)蛋白均顯著低于H組,和N組,NC組表達(dá)無差異;9.mRNA結(jié)果顯示,NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA表達(dá)在H組顯著高于其他3組,HC組較H組低,但I(xiàn)L-1β和IL-18均高于N組和NC組;caspase-1的mRNA表達(dá)低于N組和NC組;10.Pearson相關(guān)性分析表明,肺組織NLRP3蛋白表達(dá)水平和IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。11.Western blot結(jié)果表明,H組pNF-κB的蛋白水平明顯高于其他3組,HC組和N組、NC組的蛋白表達(dá)無差異,H組和HC組的p IκBα蛋白表達(dá)高于N組和NC組;12.Pearson相關(guān)性分析表明,肺組織pNF-κB的蛋白表達(dá)水平和NLRP3的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論:1.在動物模型上驗(yàn)證了BPD新生鼠生后早期持續(xù)應(yīng)用咖啡因可以改善肺發(fā)育不良的結(jié)局,這與咖啡因在臨床上的肺保護(hù)作用一致;2.咖啡因能抑制NLRP3的表達(dá)和作用,減輕肺組織的炎癥反應(yīng);3.咖啡因能抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而下調(diào)NLRP3。
【圖文】：

圖 1.1 各組肺組織濕/干重比值的比較A:各組 14d 肺組織濕/干重比值的比較；B：各組 21d 肺組織濕/干重比值的比較（n=10，**代表和其他 3 組相比，p<0.01；##代表和 N 組、NC 組相比，p<0.01）3.2 肺形態(tài)學(xué)改變3.2.1 HE 染色和 RAC 值、MLI 測定圖 1.2 各組肺組織 HE 染色（400x），可見 N 組和 NC 組肺泡在 14 天次級分隔清晰，肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)整，大小均勻，肺泡間隔較薄；H 組在 14 天肺泡數(shù)目和次級分隔數(shù)目均顯著減少，肺泡腔增大，間隔增厚，可見少許炎癥細(xì)胞浸潤；HC 組肺泡數(shù)目較 H 組增多，間隔未見明顯增厚。21 天 N 組和 NC 組肺泡數(shù)目較 14 天增多，次級分隔數(shù)目增加，肺泡發(fā)育正常，H 組盡管于 14 天后轉(zhuǎn)至空氣，但肺發(fā)育仍落后于其他 3 組，HC 組肺泡數(shù)目較 H 組增多，間隔略增厚。

圖 1.1 各組肺組織濕/干重比值的比較A:各組 14d 肺組織濕/干重比值的比較；B：各組 21d 肺組織濕/干重比值的比較（n=10，**代表和其他 3 組相比，p<0.01；##代表和 N 組、NC 組相比，p<0.01）3.2 肺形態(tài)學(xué)改變3.2.1 HE 染色和 RAC 值、MLI 測定圖 1.2 各組肺組織 HE 染色（400x），可見 N 組和 NC 組肺泡在 14 天次級分隔清晰，肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)整，大小均勻，肺泡間隔較薄；H 組在 14 天肺泡數(shù)目和次級分隔數(shù)目均顯著減少，肺泡腔增大，間隔增厚，可見少許炎癥細(xì)胞浸潤；HC 組肺泡數(shù)目較 H 組增多，間隔未見明顯增厚。21 天 N 組和 NC 組肺泡數(shù)目較 14 天增多，次級分隔數(shù)目增加，肺泡發(fā)育正常，H 組盡管于 14 天后轉(zhuǎn)至空氣，，但肺發(fā)育仍落后于其他 3 組，HC 組肺泡數(shù)目較 H 組增多，間隔略增厚。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R725.6

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本文編號：2640434