【摘要】： 前言 先天性肛門直腸畸形(Anorectal Malformations,ARMs)是小兒常見的消化道畸形,是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測(cè)的先天畸形之一,占消化道畸形的1/4,發(fā)病率為1/5000～1/1500。盡管長期以來人們對(duì)肛門直腸畸形的手術(shù)方式進(jìn)行著不斷的改進(jìn),但中、高位ARMs的術(shù)后長期隨訪顯示,仍有許多患者存在不同程度的排便、控便功能障礙。術(shù)后肛門直腸功能障礙是盆底神經(jīng)肌肉發(fā)育不良所致,而腸道動(dòng)力無疑是影響直腸肛管控便屏障最重要的因素之一,研究ARMs腸神經(jīng)系統(tǒng)、腸道肌肉及神經(jīng)肌肉聯(lián)系的發(fā)育及其可能的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)很有必要。 既往研究顯示,在中、高位肛門直腸畸形患者中,其骶髓中樞及直腸末端的神經(jīng)系統(tǒng)有不同程度的改變,但迄今為止,對(duì)其胚胎發(fā)育過程和詳細(xì)的病理改變尚不清楚。 胚胎學(xué)的研究進(jìn)展已初步闡明腸神經(jīng)系統(tǒng)胚胎學(xué)發(fā)生的機(jī)制。腸神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎發(fā)育來源于迷走神經(jīng)嵴及骶神經(jīng)嵴細(xì)胞,循腸管頭尾方向發(fā)育增殖。ARMs在畸形發(fā)生后,是否伴隨著神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移異常呢?抑或?yàn)檫w移至腸壁后發(fā)育增殖異常呢?這些都是尚未解決的問題。先天性肛門直腸畸形的病因至今仍不明了。目前認(rèn)為,肛門直腸畸形的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明遺傳因素在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。最近國外學(xué)者利用肛門直腸畸形動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Shh、Hox、Fgf10、Wnt5a等多種基因在消化道末端發(fā)育中發(fā)揮重要作用。當(dāng)上述基因異常均可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)肛門閉鎖、肛門開口異位等畸形。在ARMs發(fā)生后,這些信號(hào)分子是否仍然繼續(xù)在腸道發(fā)育中發(fā)揮重要作用并且在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)是否存在異常呢? 在上述眾多的信號(hào)分子中,高度保守的Wnt信號(hào)蛋白家族在胚胎發(fā)育中發(fā)揮著尤其重要的作用,已經(jīng)引起了許多學(xué)者的注意。Wnt蛋白通過不同信號(hào)分子間的相互作用,觸發(fā)了調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、遷移、分化及發(fā)育等多方面的復(fù)雜信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),其中對(duì)Wnt5a的研究正在逐漸增多,但多是涉及人體各個(gè)系統(tǒng)發(fā)生的常見腫瘤,對(duì)于其在調(diào)控腸道發(fā)育胚胎發(fā)育的研究剛剛起步,尤其對(duì)于ARMs腸神經(jīng)肌肉發(fā)育調(diào)控的機(jī)制目前尚不清楚。 本文應(yīng)用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸的Wistar大鼠的ARMs動(dòng)物模型,利用神經(jīng)元、突觸囊泡蛋白及氮能神經(jīng)元的發(fā)育作為評(píng)價(jià)腸神經(jīng)系統(tǒng)及腸道神經(jīng)肌肉發(fā)育的標(biāo)志物,應(yīng)用相應(yīng)的抗體即蛋白基因產(chǎn)物(protein gene product9.5,PGP9.5)、突觸素(synaptophysin,SYP)及一氧化氮合成酶(nitric oxidesynthases,NOs)觀察上述指標(biāo)在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)及變化;同時(shí)分析Wnt5a及其受體Frizzled-1、TCF4蛋白和mRNA在正常及ARMs大鼠結(jié)腸的表達(dá)及變化情況,探討正常及ARMs大鼠與排便控制密切相關(guān)的腸神經(jīng)系統(tǒng)及腸道平滑肌的胚胎期發(fā)育的可能調(diào)控機(jī)制。另外,我們采用ARMs患兒的直腸末端組織對(duì)Wnt5a的表達(dá)進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證,以期得到一些更為有益的研究啟示。 實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 體重250～300克的Wistar大白鼠,由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物部提供。 2、病例標(biāo)本: ARMs患兒直腸末端標(biāo)本20例:男14例,女6例,平均年齡8.5個(gè)月;其中高位畸形5例,中位畸形7例,低位畸形8例。7例死于非胃腸道疾病患兒的直腸末端標(biāo)本為對(duì)照組:男5例,女2例,平均年齡7.3個(gè)月。 3、實(shí)驗(yàn)試劑: ①PGP9.5單克隆抗體(購自美國Abcam公司);②SYP單克隆抗體、NOs、Wnt5a、Frizzled-1和TCF4多克隆抗體(購自美國Santa Cruz公司);③免疫組化Ultra Sensitive~(TM)Sp超敏試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);二步法山羊免疫組化檢測(cè)試劑盒(購自北京中杉金橋公司);④乙烯硫脲(Ethylenethiourea,ETU)(購自德國Sigma-Aldrich公司);⑤逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自大連寶生物工程有限公司);⑥總蛋白抽提試劑盒(購自賽馳公司)。 實(shí)驗(yàn)方法 在成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天(E10),按125mg/kg經(jīng)胃管給予孕鼠灌入ETU(濃度為1%,以生理鹽水做溶劑),制作ARMs大鼠動(dòng)物模型;對(duì)照組給予等量的生理鹽水。分別在大鼠E15-E21時(shí)剖宮取胎,部分取完整胚胎或胚胎盆部,經(jīng)4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定、脫水后制成蠟塊,行矢狀面、橫斷面的連續(xù)切片,分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):①PGP9.5、SYP及NOs免疫組化/熒光染色,以其作為胚胎期ENS發(fā)育的標(biāo)志物,觀察正常和ARMs大鼠ENS的胚胎發(fā)育過程;②進(jìn)行Wnt5a、Frizzled-1、TCF4的免疫組化染色來大體比較上述因子在直腸壁內(nèi)的表達(dá)情況。另一部分鼠胚通過顯微鏡下取材獲得末端直腸標(biāo)本,部分進(jìn)行Wnt5a、Frizzled-1及TCF4 mRNA的RT-PCR實(shí)驗(yàn),其余部分標(biāo)本進(jìn)行PGP9.5、SYP、NOs、Wnt5a、Frizzled-1及TCF4的western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白定量分析,G:BOXSYNGENE凝膠分析系統(tǒng)拍照,Kodark Digital Science 1.0 DNA分析軟件進(jìn)行半定量分析。所有數(shù)據(jù)均以(?)表示,差異比較采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各胎齡正常組與ARMs組的t檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 人類正常及ARMs直腸末端標(biāo)本進(jìn)行Wnt5a的免疫組化及Western blot實(shí)驗(yàn),對(duì)其表達(dá)進(jìn)行定位和定量,并比較分析。 結(jié)果 1、正常與ARMs的直腸內(nèi)ENS的胚胎發(fā)育過程及比較 ①PGP9.5標(biāo)記的神經(jīng)元的在直腸內(nèi)的遷移發(fā)育情況:通過免疫組化結(jié)果顯示,正常對(duì)照組,E16時(shí):神經(jīng)嵴細(xì)胞已經(jīng)定植于整個(gè)后腸,直腸壁內(nèi)可見散在陽性細(xì)胞,這時(shí)環(huán)肌層剛剛開始分化;從E16到E18,PGP9.5陽性細(xì)胞出現(xiàn)在環(huán)肌漿膜側(cè)即肌間神經(jīng)叢部位,成散在單個(gè)出現(xiàn),E17-18時(shí)的直腸末端的縱肌纖維分布仍然稀疏,粘膜下PGP9.5陽性細(xì)胞少見;E20時(shí),可以觀察到黃褐色團(tuán)塊狀的PGP9.5陽性反應(yīng)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,呈團(tuán)簇狀,粘膜下也可見陽性細(xì)胞,E21天更為明顯。而在同張切片中觀察,同期的中腸腸壁的神經(jīng)發(fā)育較后腸明顯成熟。而在ARMs組:E16-17時(shí)神經(jīng)嵴細(xì)胞在畸形組直腸中也可顯示,與正常組定位無明顯差異,但在直腸尿道瘺管周圍未見陽性細(xì)胞;E18-19后近直腸盲端處仍可見陽性細(xì)胞,但分布與正常組相比,陽性細(xì)胞的分布較稀疏,瘺管周圍仍未見陽性細(xì)胞分布;E20-21的直腸盲端陽性細(xì)胞分布與上位正常段結(jié)腸及正常組相比,密度減低,分布更為稀疏,并未見明顯的神經(jīng)細(xì)胞簇形成,發(fā)育滯后更明顯。 ②NOs標(biāo)記的氮能神經(jīng)元發(fā)育情況:通過免疫熒光結(jié)果顯示,與神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移發(fā)育過程伴隨,氮能神經(jīng)元的發(fā)育與之大致同步,但大約晚于PGP9.5陽性細(xì)胞出現(xiàn)在直腸區(qū)域一天以后,即出現(xiàn)在大鼠E17后的直腸壁內(nèi);E18時(shí),直腸壁肌間出現(xiàn)清晰的陽性神經(jīng)元,胞漿處有明顯的熒光標(biāo)記,出生前陽性神經(jīng)元發(fā)育更趨于成熟;ARMs組與正常組相比,發(fā)育明顯滯后;胎齡越大,差別越明顯。 ③SYP的表達(dá)情況:正常對(duì)照組觀察到:在E17時(shí),直腸上端結(jié)腸壁內(nèi)只能見散在零星分布熒光顯示,但非常微弱;E18開始,結(jié)直腸壁內(nèi)可見清晰強(qiáng)綠色熒光,主要分布在腸壁肌間位置,連續(xù)成條索狀,上端結(jié)腸較直腸更為清晰,到E20以及出生前,熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。在ARMs組:E16-17時(shí)結(jié)直腸大部分未見熒光顯示,上位結(jié)腸與直腸處相比,偶可見極弱的零星分布的熒光;E18后上位結(jié)腸的發(fā)育更為成熟,近直腸盲端處仍可見綠色熒光,與上位正常段結(jié)腸及正常組相比,強(qiáng)度減弱,差別更明顯,瘺管周圍未見熒光顯示。 ④PGP9.5、SYP和NOs的western blot結(jié)果顯示上述因子的蛋白定量結(jié)果在E19、E21時(shí)兩組均存在差別,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、Wnt5a等發(fā)育相關(guān)因子在正常和ARMs大鼠直腸壁胚胎發(fā)育期的表達(dá)對(duì)比 ①Wnt5a、Frizzled-1、TCF4免疫組化染色結(jié)果:正常組從E16～E21,肌間神經(jīng)叢及腸道平滑肌及直腸粘膜層部位均觀察到上述因子的表達(dá),但是表達(dá)強(qiáng)度存在細(xì)微差別,隨著腸管的發(fā)育成熟,其表達(dá)逐漸增強(qiáng),不同部位間表達(dá)強(qiáng)度的差異也更明顯,神經(jīng)叢及腸道平滑肌的表達(dá)更強(qiáng)一些。ARMs組:E16時(shí),未見陽性反應(yīng)的細(xì)胞;E17-E21,陽性細(xì)胞逐漸顯現(xiàn),與正常胎齡的直腸同區(qū)域相比,表達(dá)減弱,在瘺管周圍無陽性反應(yīng)細(xì)胞。 ②Wnt5a、Frizzled-1和TCF4的western blot結(jié)果更清晰的顯示了兩組間三種蛋白定量的差別。 ③Wnt5a、Frizzled-1及TCF4 mRNA的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,E17、19、21時(shí),Wnt5a、Frizzled-1及TCF4在正常組表達(dá)水平較ARMs組高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。與免疫組化及western blot結(jié)果基本相符。 3、Wnt5a在正常和ARMs人類直腸壁表達(dá)的對(duì)比結(jié)果 Wnt5a蛋白表達(dá)為棕黃色顆粒狀,表達(dá)于人直腸壁肌間神經(jīng)叢、粘膜層和粘膜下層,呈彌漫性全漿表達(dá),肌層表達(dá)較弱。ARMs患兒的直腸壁并未觀察到陽性表達(dá)細(xì)胞。Western蛋白印跡結(jié)果顯示,ARMs高位組、中位組和低位組的蛋白表達(dá)水平均明顯低于后天瘺組和正常對(duì)照組(P＜0.05)。不同畸形之間,高位組和中位組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11),但二者明顯低于低位組(P＜0.01)。后天瘺組與正常對(duì)照組比較沒有明顯差異(P=0.67) 結(jié)論 1、在正常及ARMs大鼠胚胎,在E16左右,神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移到直腸區(qū)域,但直腸末端神經(jīng)發(fā)育很差,隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育,直腸區(qū)域的腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育逐漸完善,逐漸形成神經(jīng)叢狀結(jié)構(gòu),生后發(fā)育更加完善。ARMs大鼠胚胎的ENS在E16時(shí),其形態(tài)與正常組無明顯差異,從E18起,可觀察到發(fā)育異常的ENS,隨著胎齡的加大,與正常相比,發(fā)育差異更加顯著。 2、氮能神經(jīng)元作為重要的神經(jīng)元亞型,其發(fā)育過程是伴隨神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移而發(fā)育的,但稍遲一些,推測(cè)NO可能在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中也起著重要作用,ARMs大鼠胚胎直腸末端區(qū)域的突觸素的發(fā)育較正常組差,可能也是導(dǎo)致腸道動(dòng)力改變的一個(gè)原因。 3、E16～E21,Wnt5a及其受體Frizzled-1及Wnt經(jīng)典通路的關(guān)鍵因子TCF4在ARMs組的腸壁粘膜、肌層及腸神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)較正常組減弱,可能與ARMs直腸神經(jīng)系統(tǒng)及直腸末端壁平滑肌發(fā)育不良的調(diào)控相關(guān)。 4、Wnt5a主要表達(dá)在人類直腸壁肌間神經(jīng)叢部位,在肛門直腸畸形患者的直腸末端表達(dá)水平減低,推測(cè)Wnt5a在人類先天性肛門直腸畸形發(fā)生后的直腸神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)一步的發(fā)育中可能具有重要調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

PGPg.5在正常組直腸壁內(nèi)的IHC染色情況(圖A，，a)(PGPg.5100x;圖 a400x矢狀面切片)U，尿道;R，直腸圖2， E16PGPg.5在正常組(圖A，a)和ARMs組(圖B，b)IHC染色中的表達(dá)情況 (PGPg.5IHC圖A， B40x，圖a， b4O0x矢狀面切片)U，尿道;R

表達(dá)情況R，直腸; E17PGPg.5在正常組(圖A，a)和ARMs組(圖B，b)IHC染色中的 (pGPg.5IHC圖A， B40x，圖a， b400x矢狀面切片)U
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R726.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2640483