【摘要】： 新生兒黃疸是新生兒期臨床常見病癥,由膽紅素產(chǎn)生和排泄失衡所致,發(fā)生率較高,約占新生兒的2/3。膽紅素對神經(jīng)系統(tǒng)有損害,嚴(yán)重黃疸者可引起膽紅素中毒性腦病,約占新生兒黃疸的0.5~2%,造成兒童智力障礙甚至死亡,有很高的致死率或致殘率。 血紅素加氧酶(Heme Oxygenase, HO)是血紅素代謝為膽紅素的限速酶,其中HO-1可被多種因素誘導(dǎo)。本課題先通過RNA干擾技術(shù)在體外BRL細(xì)胞水平特異下調(diào)HO-1基因的表達(dá),探討通過降低HO-1表達(dá)以阻斷膽紅素產(chǎn)生;然后用有效的siRNA注射新生鼠黃疸模型降低膽紅素生成,以期尋找出一條新的早期防治新生兒高膽紅素血癥及膽紅素中毒性腦病新的有效途徑。 針對大鼠HO-1基因設(shè)計并化學(xué)合成四組小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)。用INTERFERin轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的siRNA,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%。通過RT-PCR篩選出具最佳抑制效果的序列——siRNA-4,10nM siRNA轉(zhuǎn)染24h后RT-PCR檢測抑制效率77%;siRNA-1、2也有一定程度的抑制。siRNA-4對于HO-1基因的最佳作用濃度為10 nM,mRNA水平抑制最佳作用時間為24 h。體外經(jīng)濃度梯度、時間梯度檢測證實3μg/mL血紅素刺激,就能誘導(dǎo)HO-1高表達(dá),18 h誘導(dǎo)效果最好。siRNA-4亦可降低被誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá),實驗證實最佳作用時間36 h,抑制效率可達(dá)64%。 我們通過對7~10天齡SD大鼠3次腹腔注射50μM(/100 g體重)ALA能誘導(dǎo)HO-1表達(dá)和血清膽紅素生成,HO-1升高到原來3倍,總膽、直膽。間膽濃度都升高,依此構(gòu)建新生鼠黃疸模型。此模型大鼠經(jīng)腹腔注射半甲氧基修飾的siRNA-4,實驗證實5 OD/(20 g體重)劑量siRNA-4注射2 d后對總膽紅素抑制效率43%,10 OD/(20 g體重)抑制效率50%;HO-1蛋白抑制效率各為30%和42%。5 OD/(20 g體重)劑量注射時,最后一次注射后1天、2天、3天總膽紅素的降低效果分別是36%、45%、27%,HO-1蛋白抑制效果分別是26%、33%、18%。 體外、體內(nèi)實驗表明,運用分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計合成的siRNA-4能夠有效抑制干擾HO-1基因表達(dá),進(jìn)而減少膽紅素產(chǎn)生,為早期防治新生兒黃疸和膽紅素中毒性腦病提供了一條新的有效途徑依據(jù)。
【圖文】：

圖 1. 膽紅素代謝途徑[13]Figure 1. Bilirubin metabolic pathway在膽紅素代謝過程中，從血紅素經(jīng)過兩部反應(yīng)生成膽紅素，限速酶是血紅素氧化酶。至今已發(fā)現(xiàn)三種 HO 同工酶：HO-1、HO-2 和 HO-3[14-16]。三種異構(gòu)體雖然在氨基酸序列及誘導(dǎo)性上有所不同，但具有共同的催化底物，催化機(jī)制及反應(yīng)產(chǎn)物。HO-1 分子量為 33 kDa，由 288 個氨基酸殘基構(gòu)成，為熱休克蛋白 32（HSP32）。血紅素、金屬元素、氧化應(yīng)激、紫外照射、高溫、某些特定藥物以及還原型谷胱甘肽等均能誘導(dǎo) HO-1，而且研究發(fā)現(xiàn) HO-1 在肝臟和脾臟中濃度最高。Shibahara S 等報道人與大鼠 HO-1 基因的同源性為 80％[17]。HO-2 由 361個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為 36 kDa。研究表明 HO-2 和 HO-1 是兩種不同的基因產(chǎn)物，基因序列同源性僅 40％。HO-2 的 N-末端較 HO-1 多 20 個氨基酸殘基，兩者的 C-末端都有疏水序列，該序列的末端分別與微粒體膜相連。與 HO-1 相反，，HO-2 不被外因誘導(dǎo)，在腦和睪丸中濃度最高。HO-3 是一個約 2.4 kb 的單一轉(zhuǎn)錄

目前認(rèn)為 RNA 干擾的機(jī)制可能是由于外源性 RNA 病毒入侵或轉(zhuǎn)座子等原因，使宿主細(xì)胞中出現(xiàn)異常的雙鏈 RNA 分子（dsRNAs）[50]。這些異常的 dsRNAs在 Dicer 酶的作用下，能被特異的切割成為分子量約～22nt 的小干擾 RNA（smallinterfering RNAs，siRNAs）。這些小的 siRNAs 可作為導(dǎo)向序列，引導(dǎo)其反義鏈與單鏈靶 mRNA 結(jié)合，共同形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNAinduced silencingcomplex，RISC）。其反義鏈與對應(yīng)同源的靶 mRNA 結(jié)合，有意義鏈解離出來，宿主 mRNA 被降解，同時釋放出 Dicer 酶。然后不斷重復(fù)這一過程，特異性降解下一個對應(yīng)的 mRNA[51]。其中 Dicer 酶的作用很重要也是必不可少的�，F(xiàn)認(rèn)為它是 RNAse Ⅲ家族的成員之一。它包括一個螺旋結(jié)構(gòu)域、兩個 RNA 酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域、兩個 dsRNA 結(jié)合域以及一個 PAZ 結(jié)構(gòu)域。在植物、線蟲、果蠅和哺乳動物體內(nèi)均存在 Dicer 酶的同源體，這些蛋白結(jié)構(gòu)相似，具有相似的生化功能，說明 RNA干擾這種調(diào)節(jié)具有進(jìn)化保守的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)， 進(jìn)一步提示它可能是生物體的一種進(jìn)化保守機(jī)制[52]。圖 2 是 RNA 干擾機(jī)制的簡單示意圖。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R722.1

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本文編號：2639346