【摘要】：再生障礙性貧血(aplastic anemia, AA)簡稱再障,是一組由化學、物理、生物、藥物及不明因素引起的骨髓造血干/祖細胞與造血微環(huán)境損傷,導致骨髓造血功能衰竭及外周血全血細胞數量減少的一種疾病。由于病因及發(fā)病機制尚未完全明確,故治療較困難,是兒童常見的難治性血液病之一。再障發(fā)病機理較為復雜,以往學者多認為,造血干細胞損傷、造血微環(huán)境缺陷和免疫介導因素導致了再障的發(fā)生,此三種發(fā)病機制在不同的患者體內單獨存在或聯合作用,導致造血功能衰竭。目前越來越多的臨床及實驗室研究證實,免疫系統的紊亂包括T淋巴細胞數量和功能異常所造成的造血抑制,在AA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。臨床資料顯示約70%左右再障患者應用免疫抑制劑如抗胸腺細胞球蛋白(ATG)/抗淋巴細胞球蛋白(ALG)及環(huán)孢菌素(CsA)治療有效,提示了免疫功能異常因素介導的造血抑制在再障發(fā)病中的重要作用。 近年來CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Treg)引起國內外學者的廣泛關注,它在維持外周免疫耐受中起著重要作用。臨床研究發(fā)現,CD4+CD25+Treg細胞與多種自身免疫性疾病、移植排斥、腫瘤及病毒感染相關。國外有學者研究表明,CD4+CD25+T淋巴細胞被分為三個表型：CD25high+、CD25intermediate+和CD25low+。具有免疫抑制功能的Tregs高表達IL-2Rα(CD25),另外也表達轉錄因子Foxp3,其表型顯示為CD4+CD25high。最近國內學者在分析中國健康人外周血中CD4+CD25+Treg細胞表達頻率時,采用三色免疫熒光染色分析技術分選了具有CD4+CD25int/highCD127low表達特征的細胞群。經胞內Foxp3染色的結果亦證實：CD25int/highCD127low表達的細胞Foxp3陽性,而CD25lowCD127high細胞幾乎全部Foxp3表達陰性。由此提示CD25int/highCD127low可作為Treg細胞表面的特征性標志物而用于Treg的分選。 轉錄因子Foxp3及活化的T細胞核因子(NFAT)在Treg的發(fā)育和分型中起重要的作用。有實驗證實：Foxp3決定了調節(jié)性T細胞的抑制功能,且Foxp3可能通過翻譯水平來改變調節(jié)性T細胞的抑制功能。活化T細胞核因子(NFAT)是T細胞受體(TCR)介導的信號轉導通路中非常關鍵的轉錄因子。NFAT家族主要包括NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4四個成員。Solomou等發(fā)現：再生障礙性貧血患者外周血單個核細胞中Treg的表達降低,Foxp3在蛋白水平和mRNA水平也是顯著降低的,同時伴隨著NFAT1蛋白的降低,并且NFAT1蛋白的低表達可能可以解釋Foxp3的低表達和Treg的減少頻率。而目前國內關于Foxp3、NFAT1蛋白在兒童再障發(fā)病機制中的作用、兩者之間的關系及其與再障預后的聯系尚少見報道。 目的 本研究應用流式細胞術、免疫印跡試驗(Western-blotting)的方法檢測慢性再障(CAA)患兒及正常兒童外周血單個核細胞中Treg細胞及在其發(fā)育和分型中起重要作用的轉錄因子Foxp3及NFAT1在蛋白水平的表達,探討它們之間的相互關系及在再障的免疫學發(fā)病機制中的原理,為再障的防治提供可行思路,并為探究再障的免疫抑制治療方法提供可能的理論依據。 材料與方法 1研究對象 收集鄭州大學第三、第一附屬醫(yī)院2009年10月至2010年6月兒科住院及門診的慢性再障患兒,將其分成兩組：初治期22例和恢復期22例,每組中男12例,女10例,年齡2-11歲；正常對照組為我院外科近期無感染、無免疫相關性疾病患兒,共計15例,男8例,女7例,年齡1-11歲,其體檢各項指標均在正常范圍內。各組之間年齡差異均無統計學意義(P0.05)(見表3.1)。診斷及療效標準均符合《小兒再障診療建議》,所有恢復期患兒均不需輸血。 2方法 應用流式細胞術檢測外周血CD4+CD25int/highCDl 27low Treg細胞的表達水平；提取外周血單個核細胞,并提取該細胞中的總蛋白,用Western-blotting的方法檢測NFAT1、Foxp3蛋白的表達水平,實驗所得的X光片結果應用掃描儀進行掃描,應用Quanity One軟件分析圖片中目的條帶的平均灰度及背景灰度,前者減去后者作為統計分析的數值,各樣品的最后統計數值為其灰度值與相應內參灰度值之比。 3統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理,所有原始數據均進行正態(tài)性、方差齊性檢驗,實驗數據均以均數±標準差(x±s)表示,多樣本均數間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較分析采用LSD-t法,各變量之間的相關性分析采用Pearson相關檢驗,以α=0.05為檢驗水準。 結果 1.CAA初治期患兒外周血中CD4+CD25+、CD4+CD25high、CD4+CD25+CD127low、CD4+CD25highCD127low占CD4+T細胞的百分比均較對照組降低(P0.05)；恢復期的表達則較初治期升高(P0.05),而與對照組差異無統計學意義(P0.05) 2.CAA初治期患兒外周血單個核細胞中Foxp3、NFAT1蛋白的表達水平分別為0.86±0.06、0.77±0.08；較對照組明顯降低(P0.05)；恢復期的表達水平分別為1.20±0.26、1.11±0.12；較初治期明顯升高(P0.05)。 3.相關性分析 (1)CAA患兒CD4+CD25highCD127low調節(jié)性T細胞與外周血單個核細胞內Foxp3、NFAT1蛋白的表達均呈正相關(r分別為0.857,0.880,P0.05)。 (2) CAA患兒外周血單個核細胞內Foxp3與NFAT1蛋白的表達呈正相關(r=0.807,P0.05)。 結論 1.CAA患兒外周血CD4+CD25int/highCD127lowTreg細胞和NFAT1、Foxp3蛋白表達均降低,有可能在慢性再障的發(fā)病過程中起重要作用,且初治期表達低于恢復期,有望用于再障療效的評估。 2. Foxp3與NFAT1蛋白表達水平呈正相關,說明兩者在Treg的發(fā)育和分化中起協同作用。
【圖文】：

CD4籠D25"`""氣D127}0"}Treg的流氏細胞學圖
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R725.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 王西閣;王曉格;欒斌;胡姬婷;;調節(jié)性T細胞及Foxp3基因在再生障礙性貧血患兒外周血中的變化及意義[J];中國當代兒科雜志;2010年04期

2 王盈;周磊明;宮菊麗;周明奎;沈方偉;鄭曉虹;張瑋;莊鳴華;盧偉;鐘平;潘啟超;康來儀;;中國健康人外周血中具有CD4~+CD25~(nt/hi)CD127~(lo)特征的調節(jié)性T細胞頻率[J];細胞與分子免疫學雜志;2007年09期

3 韓文敏;邱國強;周民;任敏;謝曉寶;;CD4~+CD25~(+/high)CD127~(low)Tregs及TGF-β在多發(fā)性骨髓瘤患者外周血的表達分析[J];細胞與分子免疫學雜志;2008年10期

4 張榮成;王萌萌;王建春;;鈣調神經磷酸酶信號通路在心肌肥厚中的作用[J];心血管病學進展;2007年02期

5 王冰濤;馬向濤;余力偉;;STATs信號轉導通路選擇性活化與乳腺浸潤性導管癌的研究[J];中華實驗外科雜志;2007年09期

6 和虹,邵宗鴻,何廣勝,劉鴻,施均,付蓉,趙明峰,白潔,賈海蓉,孫娟,崔振珠,儲榆林,楊天楹,楊崇禮;Th1細胞在再生障礙性貧血發(fā)病機制中的作用[J];中華血液學雜志;2002年11期

，

本文編號：2639218