【摘要】：早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷是導(dǎo)致早產(chǎn)兒死亡和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因,嚴(yán)重危害早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量,目前尚缺乏有效的防治措施。少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞(OPC)是早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的主要靶細(xì)胞,凋亡是OPC死亡的主要形式。死亡受體途徑是OPC的凋亡的主要途徑；該途徑由腫瘤壞死因子超家族介導(dǎo)。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(Tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中的一員,近年來研究發(fā)現(xiàn)TRAIL及其受體在正常細(xì)胞廣泛表達(dá),并參與細(xì)胞的存活和免疫監(jiān)視,因而備受關(guān)注。該受體在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究主要集中在脫髓鞘疾病,目前尚缺乏TRAIL受體表達(dá)調(diào)控對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用的研究,也缺少TRAIL及其受體在發(fā)育中腦白質(zhì)損傷中的作用的研究報(bào)道。因此,進(jìn)一步探索TRAIL及其受體在少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育中的作用,以及調(diào)控TRAIL受體對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用,將有助于我們更好的理解早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的發(fā)病機(jī)制,為更有效地防治早產(chǎn)兒腦損傷提供新的思路。第一部分 人少突膠質(zhì)系細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)及分化鑒定應(yīng)用條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)方法對(duì)人少突膠質(zhì)前體細(xì)胞株(HOPC)進(jìn)行培養(yǎng)。通過免疫組織化學(xué)方法培養(yǎng)細(xì)胞的進(jìn)行鑒定。人少突膠質(zhì)祖細(xì)胞PDGFRα熒光標(biāo)記陽性,人前少突膠質(zhì)細(xì)胞O4熒光標(biāo)記陽性,人未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞O1熒光標(biāo)記陽性,成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞MBP熒光標(biāo)記陽性。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的純度進(jìn)行鑒定,少突膠質(zhì)祖細(xì)胞組中PDGFRα(+)/O4(-)細(xì)胞的百分比為97.06%；前少突膠質(zhì)細(xì)胞組中04(+)/O1(-)細(xì)胞的百分比為96.01%；未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞組中04(+)/O1(+)細(xì)胞的百分比為95.3%；成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞組中MBP(+)細(xì)胞的百分比為91.6%。我們選用的HOPCs具有少突膠質(zhì)祖細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點(diǎn)；通過不同的條件限定培養(yǎng)基,HOPCs可以分化為前少突膠質(zhì)細(xì)胞、未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞；通過此方法可獲得高純度的少突膠質(zhì)祖細(xì)胞、前少突膠質(zhì)細(xì)胞、未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。第二部分TRAIL及受體在少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育中的表達(dá)及作用既然我們獲得了高純度的少突膠質(zhì)祖細(xì)胞、前少突膠質(zhì)細(xì)胞、未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞,通過RT-PCR及Western blot 2種方法,分別從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)4組處于不同發(fā)育階段中的人少突膠質(zhì)細(xì)胞表面TRAIL及其受體的表達(dá)情況。在不同發(fā)育階段的4組人少突膠質(zhì)細(xì)胞上均未檢測(cè)到TRAIL的表達(dá),但是4組細(xì)胞的表面均可檢測(cè)到TRAIL受體的表達(dá)。不同發(fā)育階段的人少突膠質(zhì)細(xì)胞表面的TRAIL受體的表達(dá)存在差異性。TRAIL-R1和TRAIL-R2在人少突膠質(zhì)祖細(xì)胞及前體細(xì)胞呈現(xiàn)出高表達(dá)性；而TRAIL-R3和TRAIL-R4則主要表達(dá)在未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的表面。再分別給予不同發(fā)育階段的4組人少突膠質(zhì)系細(xì)胞以不同濃度的重組可溶性TRAIL刺激后(2 ng/ml; 20 ng/ml; 200 ng/ml及2000 ng/ml),通過流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC和PI)觀察細(xì)胞的凋亡情況。隨著TRAIL濃度的增加,各組細(xì)胞的凋亡率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)；TRAIL對(duì)少突膠質(zhì)系細(xì)胞的損傷作用呈現(xiàn)明顯的量—效關(guān)系和成熟依賴性。TRAIL主要誘導(dǎo)少突膠質(zhì)祖細(xì)胞和前少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。TRAIL誘導(dǎo)少突膠質(zhì)系細(xì)胞的凋亡主要發(fā)生在TRAIL刺激后的24-48 h。第三部分 下調(diào)DR4/DR5,上調(diào)DcRl/DcR2對(duì)OPC的保護(hù)作用我們發(fā)現(xiàn)TRAIL受體在少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過程中的表達(dá)存在差異,TRAIL誘導(dǎo)少突膠質(zhì)系細(xì)胞的凋亡呈現(xiàn)量-效關(guān)系和成熟依賴性。于是我們進(jìn)一步探索調(diào)控TRAIL受體是否對(duì)OPC具有保護(hù)作用。采用小分子siRNA干擾下調(diào)少突膠質(zhì)祖細(xì)胞上的TRAIL-DR4/DR5的表達(dá)；采用pcDNA3.1慢病毒包埋上調(diào)少突膠質(zhì)祖細(xì)胞上的TRAIL-DcRl/DcR2的表達(dá)。分別給予siRNA-DR4組、siRNA-DR5組、pcDNA3.1-DcRl組和pcDNA3.1-DcR2組細(xì)胞,4組細(xì)胞以不同濃度的重組可溶性TRAIL (2 ng/ml; 20 ng/ml; 200 ng/ml及2000 ng/ml)刺激后,通過流式細(xì)胞術(shù)觀察各組細(xì)胞的凋亡情況。在siRNA-DR4組和pcDNA3.1-DcR2組,TRAIL介導(dǎo)其發(fā)生凋亡的百分比明顯下降,且差異具有顯著性。TRAIL介導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在TRAIL干預(yù)后的24 h-48 h。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R722.6

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胡蘭,陳超;早產(chǎn)兒神經(jīng)膠質(zhì)損傷的機(jī)制[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊(cè));2005年03期

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本文編號(hào)：2637484