【摘要】：早產兒腦白質損傷是導致早產兒死亡和神經系統(tǒng)后遺癥的重要原因,嚴重危害早產兒的生存質量,目前尚缺乏有效的防治措施。少突膠質細胞的前體細胞(OPC)是早產兒腦白質損傷的主要靶細胞,凋亡是OPC死亡的主要形式。死亡受體途徑是OPC的凋亡的主要途徑；該途徑由腫瘤壞死因子超家族介導。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(Tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中的一員,近年來研究發(fā)現(xiàn)TRAIL及其受體在正常細胞廣泛表達,并參與細胞的存活和免疫監(jiān)視,因而備受關注。該受體在神經系統(tǒng)中的研究主要集中在脫髓鞘疾病,目前尚缺乏TRAIL受體表達調控對少突膠質細胞保護作用的研究,也缺少TRAIL及其受體在發(fā)育中腦白質損傷中的作用的研究報道。因此,進一步探索TRAIL及其受體在少突膠質細胞發(fā)育中的作用,以及調控TRAIL受體對少突膠質細胞的保護作用,將有助于我們更好的理解早產兒腦白質損傷的發(fā)病機制,為更有效地防治早產兒腦損傷提供新的思路。第一部分 人少突膠質系細胞體外擴增培養(yǎng)及分化鑒定應用條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)方法對人少突膠質前體細胞株(HOPC)進行培養(yǎng)。通過免疫組織化學方法培養(yǎng)細胞的進行鑒定。人少突膠質祖細胞PDGFRα熒光標記陽性,人前少突膠質細胞O4熒光標記陽性,人未成熟少突膠質細胞O1熒光標記陽性,成熟少突膠質細胞MBP熒光標記陽性。通過流式細胞術對培養(yǎng)細胞的純度進行鑒定,少突膠質祖細胞組中PDGFRα(+)/O4(-)細胞的百分比為97.06%；前少突膠質細胞組中04(+)/O1(-)細胞的百分比為96.01%；未成熟少突膠質細胞組中04(+)/O1(+)細胞的百分比為95.3%；成熟少突膠質細胞組中MBP(+)細胞的百分比為91.6%。我們選用的HOPCs具有少突膠質祖細胞形態(tài)學和生物學特點；通過不同的條件限定培養(yǎng)基,HOPCs可以分化為前少突膠質細胞、未成熟少突膠質細胞和成熟少突膠質細胞；通過此方法可獲得高純度的少突膠質祖細胞、前少突膠質細胞、未成熟少突膠質細胞和成熟少突膠質細胞。第二部分TRAIL及受體在少突膠質細胞發(fā)育中的表達及作用既然我們獲得了高純度的少突膠質祖細胞、前少突膠質細胞、未成熟少突膠質細胞和成熟少突膠質細胞,通過RT-PCR及Western blot 2種方法,分別從mRNA水平和蛋白水平檢測4組處于不同發(fā)育階段中的人少突膠質細胞表面TRAIL及其受體的表達情況。在不同發(fā)育階段的4組人少突膠質細胞上均未檢測到TRAIL的表達,但是4組細胞的表面均可檢測到TRAIL受體的表達。不同發(fā)育階段的人少突膠質細胞表面的TRAIL受體的表達存在差異性。TRAIL-R1和TRAIL-R2在人少突膠質祖細胞及前體細胞呈現(xiàn)出高表達性；而TRAIL-R3和TRAIL-R4則主要表達在未成熟少突膠質細胞和成熟少突膠質細胞的表面。再分別給予不同發(fā)育階段的4組人少突膠質系細胞以不同濃度的重組可溶性TRAIL刺激后(2 ng/ml; 20 ng/ml; 200 ng/ml及2000 ng/ml),通過流式細胞術(Annexin V-FITC和PI)觀察細胞的凋亡情況。隨著TRAIL濃度的增加,各組細胞的凋亡率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢；TRAIL對少突膠質系細胞的損傷作用呈現(xiàn)明顯的量—效關系和成熟依賴性。TRAIL主要誘導少突膠質祖細胞和前少突膠質細胞凋亡。TRAIL誘導少突膠質系細胞的凋亡主要發(fā)生在TRAIL刺激后的24-48 h。第三部分 下調DR4/DR5,上調DcRl/DcR2對OPC的保護作用我們發(fā)現(xiàn)TRAIL受體在少突膠質細胞發(fā)育過程中的表達存在差異,TRAIL誘導少突膠質系細胞的凋亡呈現(xiàn)量-效關系和成熟依賴性。于是我們進一步探索調控TRAIL受體是否對OPC具有保護作用。采用小分子siRNA干擾下調少突膠質祖細胞上的TRAIL-DR4/DR5的表達；采用pcDNA3.1慢病毒包埋上調少突膠質祖細胞上的TRAIL-DcRl/DcR2的表達。分別給予siRNA-DR4組、siRNA-DR5組、pcDNA3.1-DcRl組和pcDNA3.1-DcR2組細胞,4組細胞以不同濃度的重組可溶性TRAIL (2 ng/ml; 20 ng/ml; 200 ng/ml及2000 ng/ml)刺激后,通過流式細胞術觀察各組細胞的凋亡情況。在siRNA-DR4組和pcDNA3.1-DcR2組,TRAIL介導其發(fā)生凋亡的百分比明顯下降,且差異具有顯著性。TRAIL介導細胞凋亡主要發(fā)生在TRAIL干預后的24 h-48 h。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R722.6

【參考文獻】

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1 胡蘭,陳超;早產兒神經膠質損傷的機制[J];國外醫(yī)學(兒科學分冊);2005年03期

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本文編號：2637484