【摘要】：目的:支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早產(chǎn)兒,尤其是極低出生體重兒和超低出生體重兒呼吸系統(tǒng)常見的并發(fā)癥之一,隨著早產(chǎn)兒存活率的改善,BPD的發(fā)生率也逐年增高。BPD患兒由于肺部發(fā)育障礙常同時(shí)伴有一系列的心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥,這些并發(fā)癥可能一直持續(xù)至成年。目前尚無(wú)治療BPD安全有效的方法,因此,弄清BPD的發(fā)病機(jī)制探尋新的治療方法已經(jīng)成為新生兒工作者的研究重點(diǎn)。肺泡II型上皮細(xì)胞(type II alveolar epithelial cells,AT-Ⅱ)是BPD肺上皮損傷的關(guān)鍵靶細(xì)胞,研究發(fā)現(xiàn),其損傷機(jī)制涉及膜脂質(zhì)過(guò)氧化、增殖受抑、凋亡過(guò)度等。AT-Ⅱ凋亡被認(rèn)為是BPD肺泡發(fā)育不良的關(guān)鍵環(huán)節(jié),然而,凋亡作為一種BPD時(shí)AT-Ⅱ損傷后的結(jié)局,是否還存在其他的調(diào)控機(jī)制,目前尚不清楚。自噬是廣泛存在于哺乳動(dòng)物神經(jīng)、呼吸、心血管以及血液等系統(tǒng)中的生物學(xué)現(xiàn)象,用于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,是發(fā)育、老化過(guò)程中普遍存在的共同機(jī)制,但自噬水平的異常則還可影響細(xì)胞凋亡或死亡的過(guò)程。為了證實(shí)BPD時(shí)自噬過(guò)程是否出現(xiàn)損傷,損傷的靶點(diǎn)在哪,我們對(duì)自噬過(guò)程的標(biāo)記物以及自噬通路中涉及到的其他蛋白進(jìn)行了檢測(cè);為了證實(shí)BPD發(fā)生發(fā)展中自噬的作用,我們予BPD模型新生大鼠應(yīng)用自噬促進(jìn)藥物或自噬抑制藥物,觀察肺泡發(fā)育情況以及凋亡水平;我們還建立了高氧暴露細(xì)胞模型,觀察細(xì)胞自噬水平改變,并應(yīng)用自噬干預(yù)藥物,明確自噬對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞損傷的作用;進(jìn)一步,我們尋找致BPD自噬水平改變可能的關(guān)鍵蛋白,為探索BPD的新機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的BPD的治療手段奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:按照我們已建立的方法,100只新生Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為模型組(暴露于O_2,FiO_2 0.8)和對(duì)照組(暴露于空氣,FiO_2 0.21)。于實(shí)驗(yàn)后的1、3、7、14、21天,每組選取10只,透射電鏡下觀察自噬小體及凋亡小體,TUNEL染色觀察凋亡細(xì)胞,免疫組化觀察LC3B、P62、lamp1及Stx17定位及表達(dá),免疫熒光雙染觀察LC3B與p180(肺泡II型上皮細(xì)胞標(biāo)志物)共定位及表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)LC3B、P62、Lamp1及St17的mRNA表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)LC3B、P62、lamp1、caspase3-cleaved及Stx17蛋白表達(dá)水平。將另140只新生SD大鼠分為三組,予新生大鼠體內(nèi)應(yīng)用自噬干預(yù)劑,每組每個(gè)劑量10只鼠。一組給BPD模型大鼠應(yīng)用雷帕霉素,劑量2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg,隔日一次;第二組予BPD模型大鼠應(yīng)用氯化鋰,劑量20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg,每天一次;第三組,給予正常新生大鼠氯喹,劑量分別為1mg/kg、10mg/kg、20mg/kg,每天一次。每組均設(shè)安慰劑組,用法均為腹腔注射,共兩周。收集肺組織標(biāo)本觀察肺組織發(fā)育情況,及自噬相關(guān)蛋白及其mRNA水平。再次選取80只新生SD大鼠,生后建立BPD模型組及對(duì)照組,予實(shí)驗(yàn)后的3、7天,每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)20只,按照我們課題組以往的貼壁選擇法分離、純化、培養(yǎng)AT-Ⅱ細(xì)胞,并進(jìn)行LC3B、P62、Lamp1蛋白及mRNA的檢測(cè)。另外,建立高氧暴露細(xì)胞模型,將AT-Ⅱ原代細(xì)胞為在FiO_2 0.8孵箱中培養(yǎng),分別在0h、6h、12h、24h、48小時(shí)后收集細(xì)胞,并應(yīng)用自噬干預(yù)藥物,應(yīng)用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活情況,應(yīng)用western-blot檢測(cè)自噬及凋亡相關(guān)蛋白水平。結(jié)果:1、BPD新生鼠中肺AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡小體及自噬體的觀察。透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)下,模型組7天凋亡細(xì)胞增多,并發(fā)現(xiàn)凋亡小體與自噬小體共存于同一AT-Ⅱ細(xì)胞的現(xiàn)象。進(jìn)一步觀察到,模型組7d可見大量自噬體,較對(duì)照組明顯增多。2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)BPD新生鼠中肺組織自噬相關(guān)蛋白及其mRNA水平的變化。Western-blot結(jié)果顯示,正常對(duì)照組隨日齡增長(zhǎng),LC3B-II、p62蛋白表達(dá)略增加,7天時(shí)明顯高于3天時(shí)的表達(dá),并伴有相對(duì)應(yīng)的mRNA的增高。模型組LC3B-II蛋白表達(dá)7天異常增高,甚至明顯高于對(duì)照組,14天后開始降低,21天表達(dá)最低,低于對(duì)照組。模型組P62的蛋白表達(dá)7天最高,明顯高于對(duì)照組,后表達(dá)持續(xù)較高。Lamp1蛋白表達(dá)隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高,7天最高,明顯高于對(duì)照組,后維持在高水平。模型組LC3B、p62、Lamp1蛋白7天時(shí)較生后3天水平增高,且明顯高于對(duì)照組,但不伴有相對(duì)應(yīng)的mRNA的增高。免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示這幾種自噬相關(guān)蛋白在肺組織幾乎所有細(xì)胞均有表達(dá),且為細(xì)胞漿染色為主,LC3B染色可以看到模型組7天較對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多,且呈點(diǎn)狀聚集增多;p62和Lamp1均顯示7天模型組陽(yáng)性染色均較對(duì)照組明顯增多,且為細(xì)胞漿染色。LC3B與p180免疫熒光雙染可見,LC3B與p180存在共定位于AT-Ⅱ細(xì)胞,且7天模型組雙染陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多。3、BPD新生鼠肺原代AT-Ⅱ細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及其mRNA的變化。Western-blot結(jié)果顯示BPD新生鼠肺原代AT-Ⅱ凋亡及自噬水平變化同BPD模型肺組織。LC3B-II及p62蛋白表達(dá)7天達(dá)高峰,明顯高于對(duì)照組,Lamp1蛋白表達(dá)同樣在7天最高,明顯高于對(duì)照組。三種蛋白的mRNA的表達(dá)模型組和對(duì)照組間未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn),應(yīng)用自噬干預(yù)藥物后BPD新生鼠中肺組織自噬蛋白水平的變化。Western-blot可見BPD新生鼠應(yīng)用雷帕霉素(rapamycin,RAPA)或氯化鋰(LiCl)后肺組織RAC值增加,肺泡間隔厚度減少,肺組織p62、LC3B-Ⅱ、caspase-3-cleaved蛋白表達(dá)降低。正常新生大鼠應(yīng)用氯喹(CQ)后,出現(xiàn)了BPD類似的表現(xiàn),RAC降低,肺泡間隔增厚,Western-blot可見p62、LC3B-Ⅱ、Caspase-3-cleaved增加。5、體外實(shí)驗(yàn),原代AT-Ⅱ細(xì)胞高氧暴露模型中自噬蛋白水平的變化。Western-blot結(jié)果顯示隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)LC3B-II、p62蛋白逐漸增高,12h最明顯,24h、48h逐漸恢復(fù),Stx17在6小時(shí)后降低,12小時(shí)恢復(fù)。6、體外實(shí)驗(yàn),應(yīng)用自噬干預(yù)藥物后原代AT-Ⅱ細(xì)胞高氧暴露模型細(xì)胞活性。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用自噬促進(jìn)劑雷帕霉素及氯化鋰后細(xì)胞存活率上升,應(yīng)用自噬抑制劑3-MA和氯喹后細(xì)胞存活率下降。7、體內(nèi)實(shí)驗(yàn),BPD新生鼠中肺組織Stx17的表達(dá)。Western-blot結(jié)果顯示BPD時(shí)Stx17蛋白表達(dá)3天開始降低,14天后升高,Rrealtime-PCR結(jié)果顯示BPD時(shí)Stx17mRNA的表達(dá)從3天開始較對(duì)照組明顯降低。8、體外實(shí)驗(yàn),原代AT-Ⅱ細(xì)胞高氧暴露模型應(yīng)用雷帕霉素后Stx17的表達(dá)變化。Western-blot結(jié)果顯示隨高氧暴露6h應(yīng)用雷帕霉素后Stx17的表達(dá)較前增加。結(jié)論:1、正常新生大鼠在生后早期快速肺發(fā)育階段,LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平及基因表達(dá)同步增高,提示正常新生大鼠肺組織的發(fā)育需要維持稍高的自噬水平。2、在BPD的早期階段,盡管LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平異常增高,但并不伴有對(duì)應(yīng)mRNA的增加,提示這種自噬相關(guān)蛋白的增高是降解障礙所致,自噬流受阻可能參與了BPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。3、在細(xì)胞水平驗(yàn)證,BPD時(shí)AT-Ⅱ細(xì)胞的LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平增高并不伴有對(duì)應(yīng)mRNA表達(dá)增加,趨勢(shì)與組織水平相似,提示BPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在AT-Ⅱ細(xì)胞自噬過(guò)程受損。4、應(yīng)用自噬促進(jìn)劑(雷帕霉素、氯化鋰)后,自噬水平恢復(fù),LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平降低,BPD新生鼠肺泡發(fā)育結(jié)果明顯改善;應(yīng)用自噬抑制劑(氯喹)后,使自噬流阻斷,LC3B-Ⅱ、p62蛋白聚集,正常新生鼠肺泡出現(xiàn)發(fā)育障礙,出現(xiàn)類似BPD的肺組織改變。5、分別在組織和細(xì)胞水平驗(yàn)證,Stx17減少與BPD自噬過(guò)程受損LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平增加密切相關(guān),提示Stx17表達(dá)降低所致自噬功能受損可能是BPD發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。
【圖文】：

是評(píng)價(jià)肺泡發(fā)育的指標(biāo)，對(duì)照組RAC值隨日齡增加逐漸增高，而模型組未見明顯改變（14天、21天均p＜0.01）。肺泡間隔厚度隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增厚（14天、21天均p＜0.01）（圖1-1）。圖1-1 肺組織形態(tài)學(xué)的改變（×200倍）。A：模型組，3d肺泡間隔增厚，7d、14d、21d肺泡體積逐漸增大，肺泡數(shù)減少，嵴樣結(jié)構(gòu)減少，肺泡間隔進(jìn)一步增厚。B：RAC值正常組逐漸增高，而模型組未見明顯改變。C：肺泡間隔厚度模型組逐漸增高。*為同時(shí)間點(diǎn)的模型組和對(duì)照組差異顯著P < 0.05，**為同時(shí)間點(diǎn)的模型組和對(duì)照組差異顯著P < 0.01。3.2 透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)透射電鏡可見正常肺泡II型上皮細(xì)胞體積較小，呈立方形，表面稍突向肺泡腔。細(xì)胞核大而圓

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文9糊不清，凋亡細(xì)胞可見胞漿中存在凋亡小體（圖1-2B），并且仔細(xì)觀察改凋亡細(xì)胞，可見同一細(xì)胞中存在多個(gè)自噬小體（圖1-2C、D）。圖1-2 透射電鏡觀察肺泡II型上皮細(xì)胞（×20000倍）A： 7天對(duì)照組正常AT-Ⅱ細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整，胞漿內(nèi)可見板層小體結(jié)構(gòu)（LB）及線粒體（Mi）；B：7天模型組大鼠肺AT-Ⅱ可見細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，細(xì)胞核固縮的凋亡小體（黑色箭頭），細(xì)胞漿中可見雙側(cè)膜結(jié)構(gòu)的自噬小體（白色箭頭，放大后見C、D）以及板層小體排除后的囊泡狀結(jié)構(gòu)；C、D：B圖細(xì)胞胞漿中的自噬小體結(jié)構(gòu)放大后可見雙層膜結(jié)構(gòu)以及包裹的細(xì)胞器。3.3 自噬及其相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)3.3.1 透射電鏡觀察自噬小體通過(guò)透射電鏡，我們觀察到對(duì)照組和模型組中均可見自噬小體。并且，模型組自噬小體數(shù)目隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，模型組7d最多，可見大量自噬體，模型14天時(shí)自噬體大多排空
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R722.6

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胡瑜;劉雪雁;張慧;富建華;薛辛東;;Bax/Bcl-2在高體積分?jǐn)?shù)氧致新生大鼠慢性肺疾病肺組織及成纖維細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2011年08期

，

本文編號(hào)：2636836