【摘要】：背景與目的 新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是由于圍產(chǎn)期缺氧窒息致新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD),臨床上出現(xiàn)腦病表現(xiàn),部分病例可留有不同程度神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,在圍產(chǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)疾病中占重要地位,是引起兒童期腦癱的主要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive K~+ channels,K_(ATP)通道)開(kāi)放對(duì)多種組織細(xì)胞缺氧缺血損傷有保護(hù)作用,該通道是電壓非依賴(lài)性配體門(mén)控通道,在缺氧缺血等病理狀態(tài)下被激活開(kāi)放,使大量K~+外流,細(xì)胞膜超極化,從而使Na~+、Ca~(2+)內(nèi)流減少,避免或減輕鈣超載、減少能耗、減輕興奮性氨基酸及氧自由基釋放,保護(hù)細(xì)胞�？肆_卡林是一種針對(duì)線(xiàn)粒體K_(ATP)通道特異性的鉀通道開(kāi)放劑(K_(ATP) channel opener, KCO),許多研究證實(shí)克羅卡林預(yù)處理能對(duì)抗缺氧缺血性腦損傷,具有神經(jīng)保護(hù)作用,然而其具體保護(hù)機(jī)制尚不明確。本文以宮內(nèi)窒息致HIBD新生大鼠為研究對(duì)象,觀察不同腦區(qū)(皮質(zhì)、海馬、小腦、丘腦、腦干)K_(ATP)通道亞基蛋白(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2B)基因表達(dá)情況,以及加用克羅卡林預(yù)處理后對(duì)不同腦區(qū)的保護(hù)作用不同,以期進(jìn)一步闡明KCOs對(duì)腦保護(hù)作用的分子機(jī)制。該研究結(jié)果為深入認(rèn)識(shí)K_(ATP)通道亞基蛋白在腦組織不同區(qū)域的表達(dá)情況提供依據(jù),為開(kāi)發(fā)特異性更高的K_(ATP)通道開(kāi)放劑治療新生兒HIE提供理論基礎(chǔ)。 材料與方法 采用剛出生SD新生大鼠250只,分為五組,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control組)、缺氧缺血組(HI組)、克羅卡林組(Cro組)、溶劑對(duì)照組(NaOH組)及克羅卡林+格列苯脲(Cro+Gli)組,每組50只。HI組、Cro組、NaOH組及Cro+Gli組均制作成HIBD模型。分別在窒息后0h、12h、24h,共給藥三次,克羅卡林每次按100ug/kg腹腔內(nèi)注射,克羅卡林+格列苯脲組在上述相同時(shí)間點(diǎn)用克羅卡林后立即腹腔注射通道抑制劑格列本脲每次300ug / kg,抑制通道開(kāi)放。NaOH組于同樣時(shí)間點(diǎn)給予腹腔注射0.1M NaOH,體積同Cro組。 對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,采用HE染色觀察病理改變和進(jìn)行顯微損傷評(píng)分,TTC染色測(cè)量腦梗死面積,RT-PCR方法檢測(cè)K_(ATP)通道亞基蛋白(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2B)基因表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用EXCEL2003和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x|-)±s)表示,采用重復(fù)測(cè)量分析(repeated measures)、方差分析(ANOVA)、LSD、SNK和Dunnett T3進(jìn)行組間均數(shù)比較,P0.05為差異有顯著性。 結(jié)果 1.神經(jīng)行為觀察及評(píng)分:正常對(duì)照組動(dòng)物未見(jiàn)明顯的神經(jīng)功能缺失,窒息組(HI組)、溶劑對(duì)照組(NaOH組)缺血缺氧后癥狀較重,出現(xiàn)煩躁不安,驚跳,呼吸加深加快,隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),出現(xiàn)嗜睡,活動(dòng)減少;重則抽搐、昏迷�？肆_卡林組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較HI組及NaOH組低,克羅卡林+格列苯脲組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較克羅卡林組高(P0.05)。窒息組與溶劑組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05,窒息組、溶劑對(duì)照組克羅卡林+格列苯脲組克羅卡林組正常對(duì)照組,P0.01,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.HE染色病理變化和顯微損傷評(píng)分:從常規(guī)HE染色的病理切片觀察結(jié)果來(lái)看,正常對(duì)照組光鏡下腦組織結(jié)構(gòu)、層次清晰,細(xì)胞數(shù)目較多,排列規(guī)則,細(xì)胞輪廓及核仁清楚可見(jiàn),細(xì)胞及間質(zhì)無(wú)水腫;HI組及NaOH組可見(jiàn)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元正常排列結(jié)構(gòu)消失,間質(zhì)水腫,神經(jīng)細(xì)胞腫脹,核結(jié)構(gòu)不清、固縮,繼而變性、壞死,有空泡變,可見(jiàn)細(xì)胞凋亡,神經(jīng)元數(shù)目明顯減少;克羅卡林組腦組織細(xì)胞亦有不同程度的水腫、變性及壞死,神經(jīng)元數(shù)目略微減少,多數(shù)細(xì)胞形態(tài)基本保持完整,細(xì)胞排列相對(duì)整齊,壞死程度較HI組及NaOH組減輕。克羅卡林+格列苯脲組腦組織形態(tài)特點(diǎn)較克羅卡林組重。HE顯微損傷評(píng)分結(jié)果:每個(gè)腦區(qū)各組通過(guò)兩兩比較,窒息組、溶劑對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05,窒息組、溶劑對(duì)照組克羅卡林+格列苯脲組克羅卡林組正常對(duì)照組,P0.05或者P0.01,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)腦區(qū)的窒息組進(jìn)行對(duì)比,海馬、皮質(zhì)小腦、丘腦、腦干,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 3.通過(guò)TTC染色測(cè)量腦梗死面積提示:正常組整個(gè)腦組織呈紅色,窒息組及溶劑組腦組織梗死區(qū)較大,克羅卡林組腦組織梗死區(qū)較小,克羅卡林+格列苯脲組腦組織梗死區(qū)較克羅卡林組大。通過(guò)兩兩比較,窒息組、溶劑對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05,窒息組、溶劑對(duì)照組克羅卡林+格列苯脲組克羅卡林組正常對(duì)照組,P0.01,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.RT-PCR方法檢測(cè)K_(ATP)通道亞單位基因在不同腦區(qū)表達(dá)情況:不同腦區(qū)Kir6.1、Kir6.2各組進(jìn)行比較,窒息組、溶劑對(duì)照組與克羅卡林+格列苯脲組、克羅卡林組、正常對(duì)照組對(duì)比,P0.01,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。窒息組與溶劑對(duì)照組對(duì)比,P0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。皮質(zhì)區(qū)Kir6.2kir6.1,海馬區(qū)Kir6.2kir6.1,P0.05,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用各腦區(qū)Kir6.2(克羅卡林組與對(duì)照組)比較,皮質(zhì)區(qū)克羅卡林與對(duì)照組表達(dá)量相近,P=0.44,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而海馬區(qū)P=0.29,也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小腦、丘腦、腦干P值均小于0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同腦區(qū)的SUR1、SUR2B各組進(jìn)行比較,窒息組、溶劑對(duì)照組與克羅卡林+格列苯脲組、克羅卡林組、正常對(duì)照組對(duì)比, P0.01,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。窒息組與溶劑對(duì)照組對(duì)比,P0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。皮質(zhì)區(qū)SUR2B SUR1,海馬區(qū)SUR1 SUR2B,P0.05,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.本實(shí)驗(yàn)顯示給予K_(ATP)通道開(kāi)放劑克羅卡林能顯著改善HIBD新生大鼠神經(jīng)功能缺損程度,減少腦組織細(xì)胞的水腫、變性及壞死程度,減少腦缺血再灌注后梗死面積。提示K_(ATP)通道開(kāi)放劑對(duì)腦缺血再灌注損傷具有重要的保護(hù)作用。 2.在新生鼠缺血缺氧性腦損傷后,通過(guò)腦損傷評(píng)分,海馬及皮質(zhì)評(píng)分最高,提示海馬和皮質(zhì)損傷程度最高。 3.同一腦組織不同部位K_(ATP)通道組成不同,而克羅卡林對(duì)損傷最嚴(yán)重的皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)有較好的保護(hù)作用,格列本脲能抑制克羅卡林的腦保護(hù)作用。
【圖文】：

附圖1：制作宮內(nèi)窒息模型及正常新生鼠腦大體觀附圖2：顯微神經(jīng)細(xì)胞HE×400 倍：圖2-1 正常組新生鼠皮質(zhì)HE×400 圖2-2 正常組新生鼠海馬HE×400圖2-3 窒息組新生鼠皮質(zhì)HE×400 圖2-4 窒息組新生鼠海馬HE×400

附圖1：制作宮內(nèi)窒息模型及正常新生鼠腦大體觀附圖2：顯微神經(jīng)細(xì)胞HE×400 倍：圖2-1 正常組新生鼠皮質(zhì)HE×400 圖2-2 正常組新生鼠海馬HE×400圖2-3 窒息組新生鼠皮質(zhì)HE×400 圖2-4 窒息組新生鼠海馬HE×400
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 黃廣;林霓陽(yáng);肖育;;K_(ATP)開(kāi)放劑克羅卡林對(duì)新生鼠缺氧缺血性腦損傷細(xì)胞凋亡的影響[J];中國(guó)婦幼保健;2006年07期

2 黃浩,李曉明,高天明;鉀通道阻斷劑TEA對(duì)大鼠全腦缺血后海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[J];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)雜志;2001年02期

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本文編號(hào)：2629529