【摘要】： 第一部分持續(xù)驚厥后幼年鼠腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的動態(tài)變化和遷移趨勢 目的:探討驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convulsion, SC)后未成熟大鼠腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的動態(tài)變化。 方法:建立幼年Wistar鼠3h SC模型,在SC后0天至40天的7個時間點上處死動物,處死前1天腹腔注射5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine, BrdU);采用免疫組化方法動態(tài)檢測海馬、胼胝體下區(qū)(subcallosal zone, SCZ)和皮層在各時間點BrdU的表達(dá),確定SC后各時間點上腦內(nèi)不同區(qū)域神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)的增殖水平和遷移趨勢。 結(jié)果:⑴正常未成熟腦海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)的顆粒細(xì)胞下層(subgranular zone,SGZ)和胼胝體下區(qū)(subcallosal zone,SCZ)以及皮層都存在少量BrdU陽性細(xì)胞;與對照組相比,SC后0天海馬DG的SGZ,海馬CA1、CA3區(qū),SCZ以及皮層BrdU陽性細(xì)胞即開始顯著升高,海馬的SGZ、CA1、CA3以及皮層于SC后2天出現(xiàn)增殖高峰,SCZ于SC后7天出現(xiàn)增殖高峰。⑵SC后2天DG分子層出現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞,SC后7天DG門區(qū)出現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞。SGZ新生細(xì)胞有向DG分子層遷移趨勢,SCZ細(xì)胞有向CA1、CA3和皮層遷移趨勢。 結(jié)論:SC刺激未成熟腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生,部分新生細(xì)胞發(fā)生異位遷移,部分細(xì)胞可能向海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷區(qū)遷移。 第二部分體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化前與分化后電壓門控鈉、鉀通道的表達(dá) 目的:觀察體外分離培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)分化前后鈉、鉀離子通道的表達(dá)。 方法:無血清培養(yǎng)體外分離、純化孕15-16天Wistar胎鼠的海馬NSCs,nestin免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞是否為干細(xì)胞,無血清促分化培養(yǎng)基促分化,β-III-tubulin、GFAP熒光鑒定分化細(xì)胞類型。顯微注射熒光黃標(biāo)記記錄細(xì)胞,采用β-III-tubulin免疫熒光染色檢測所記錄細(xì)胞是否具有神經(jīng)元表型。膜片鉗記錄NSCs分化前和分化后具有神經(jīng)元樣細(xì)胞的電壓門控鈉、鉀離子通道的表達(dá), 結(jié)果:⑴體外培養(yǎng)的海馬NSCs nestin免疫染色陽性,具有自我增殖能力能在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞;⑵膜片鉗記錄的細(xì)胞均具有神經(jīng)元表型;⑶未分化NSCs無內(nèi)向性鈉電流,分化后1天即可檢測到內(nèi)向性鈉電流;未分化和分化的NSCs均表達(dá)瞬時外向鉀電流和外向延遲整流鉀電流。 結(jié)論:⑴采用無血清培養(yǎng)方法,在體外成功分離海馬NSCs;⑵神經(jīng)發(fā)生過程中鈉通道的功能性表達(dá)可能是NSCs退出細(xì)胞周期開始分化的標(biāo)志。未分化和分化的NSCs表達(dá)兩種類型的外向性鉀離子電流。 第三部分腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中被動膜特性和電壓門控鈉、鉀通道電生理特征的影響 目的:探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)對海馬神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)被動膜特性和電壓門控鈉、鉀通道電生理特征的影響 方法:采用無血清促分化培養(yǎng)基促NSCs體外分化,選擇體外分化前期(1-4天)和體外分化后期(8-15天)具有神經(jīng)元形態(tài)細(xì)胞進行膜片鉗記錄;記錄細(xì)胞被動膜特性、鈉電流,分析鈉電流密度,擬合鈉通道激活曲線,計算半數(shù)激活電壓和斜率因子。記錄總鉀電流,分離瞬時外向鉀電流和外向延遲整流鉀電流;分析兩種電流在分化前期和后期的表達(dá)情況;分析電流密度,擬合激活曲線,計算半數(shù)激活電壓和斜率因子。 結(jié)果:⑴NSCs分化早期,BDNF促進靜息電位左移,膜電容增加,輸入阻抗降低,時間常數(shù)延長。⑵無BDNF干預(yù),對照組鈉電流密度隨分化逐漸增加;BDNF干預(yù)后,分化前期,BDNF作用組鈉電流密度明顯高于對照組;而分化后期BDNF作用組鈉電流密度明顯低于對照組;BDNF長期作用使鈉電流激活曲線右移。⑶所有記錄的細(xì)胞都表達(dá)I_(K(DR)) ;無BDNF干預(yù),對照組I_(K(A))的表達(dá)隨著分化逐漸增加;BDNF干預(yù)后,I_(K(A))的表達(dá)隨著分化逐漸降低;分化前期,BDNF作用組總鉀電流密度較對照組明顯增加;分化后期,兩個實驗組的總鉀電流密度沒有差異;無BDNF干預(yù),隨著分化對照組I_(K(A))和I_(K(DR))半數(shù)激活電壓都發(fā)生左移;分化前期,與對照組相比I_(K(A))和I_(K(DR))半數(shù)激活電壓也都發(fā)生左移,分化后期,BDNF作用組與對照組之間沒有差異。 結(jié)論:⑴分化前期為細(xì)胞被動膜特性發(fā)育的關(guān)鍵時期,BDNF在NSCs細(xì)胞形態(tài)改變的同時促進NSCs來源的神經(jīng)元樣細(xì)胞被動膜特性發(fā)育,以促進NSCs被動膜特性趨向成熟化。⑵體外培養(yǎng)NSCs分化前期(1-4天)也是細(xì)胞鈉、鉀通道發(fā)育的關(guān)鍵時期;⑶BDNF促進分化早期鈉通道的表達(dá)和/或開放,而長期作用則抑制鈉通道的表達(dá)和/或開放;使鈉通道激活曲線右移,具有抑制新生神經(jīng)細(xì)胞興奮性作用。⑷BDNF與I_(K(A))的表達(dá)密切相關(guān),BDNF可能抑制I_(K(A))的表達(dá),I_(K(A))在鉀通道的發(fā)育過程中具有一定作用;BDNF促進分化早期鉀通道激活曲線左移,鉀電流密度增加,促進鉀通道的表達(dá)和/或開放。⑸BDNF參與調(diào)節(jié)NSCs鈉、鉀離子通道發(fā)育關(guān)鍵時期,降低神經(jīng)元樣細(xì)胞興奮性,對驚厥后的產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞可能起保護作用。
【圖文】：

圖 2-1 鈉電流、動作電位和鉀電流刺激方案A: 內(nèi)向鈉電流刺激方案B: 動作電位刺激方案C: 外向鉀電流刺激方案Fig.2-1 The protocol of eliciting inward sodium currents, action potential and oupotassium currentsA: The protocol of eliciting inward sodium currentsB: The protocol of eliciting action potentialC: The protocol of eliciting outward potassium currents⑷離子通道的 I-V 曲線制作：給予連續(xù)變化的步階脈沖電壓，測量出不同脈沖電壓（Vm）下的全細(xì)胞峰值（Ip），，以 I 為 y 軸，Vm 為 x 軸，作出 I-V 曲線2 結(jié)果

斷劑河豚毒素（tetrodotoxin,TTX,100nM）阻斷，因此判斷此電流為電壓門子電流(INa)（圖 2-5C）。采用電流鉗，HP 設(shè)為-80mV,從 0mV 階躍至+160m胞注入超過基強度的脈沖去激化電流，不能誘發(fā)動作電位產(chǎn)生（圖 2-5D作用前后電流電壓關(guān)系曲線（I-V 曲線）如圖 2-5E 所示，TTX 可以明顯抑性電流。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R720.597

【共引文獻】

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本文編號：2629333