【摘要】： 心臟錐干部畸形是常見的復(fù)雜性先天性心臟病(先心病),是導(dǎo)致兒童死亡的主要原因之一。近端流出道隔對錐干部的發(fā)育至關(guān)重要。細(xì)胞縫隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)基因敲除(Cx43KO)小鼠心臟錐干部發(fā)育畸形,流出道梗阻,生后即出現(xiàn)死亡,表明Cx43在心臟流出道發(fā)育過程中起著重要作用。Cx43是連接蛋白家族中的重要一員,作為一種重要的通訊連接,是細(xì)胞間代謝偶聯(lián)、沖動傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近年來發(fā)現(xiàn)“心肌化”過程是心臟近端流出道隔發(fā)育中的一個重要事件。調(diào)控心肌化的基因及相關(guān)分子機(jī)制的研究正在成為研究熱點。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)Cx43KO小鼠心臟近端流出道隔心肌化過程異常,提示復(fù)雜的分子機(jī)制參與心臟流出道梗阻的發(fā)生。為此,本課題擬研究Cx43KO小鼠胚胎心臟近端流出道組織中基因表達(dá)譜的改變,篩選可能導(dǎo)致Cx43KO小鼠心臟流出道梗阻的關(guān)鍵基因,進(jìn)一步闡述Cx43KO小鼠心臟流出道梗阻的發(fā)病機(jī)制。 第一部分Cx43基因敲除小鼠心臟發(fā)育心肌化過程中的形態(tài)學(xué)研究 研究目的 利用Cx43基因敲除小鼠模型,探討Cx43基因敲除小鼠與野生型小鼠在心臟心肌化發(fā)育過程中的形態(tài)學(xué)差異。 材料與方法 成年2月齡Cx43基因敲除雜合子小鼠交配,選取ED11.5～15.5的胎鼠以及新生小鼠為研究對象,根據(jù)基因型分為Cx43基因敲除純合子(Cx43-/-),雜合子(Cx43+/-)及野生型(Cx43+/+),采用PCR方法鑒定基因型。顯微解剖及HE染色觀察心臟結(jié)構(gòu);免疫組織化學(xué)法測定橫紋肌肌動蛋白α-SCA的表達(dá)。 結(jié)果 1.所有Cx43-/-小鼠出生后很快死亡,其心臟大體解剖上可見右室流出道圓錐部明顯膨出。Cx43+/-新生鼠心臟無明顯異常。 2.組織切片HE染色顯示,出生后死亡的Cx43-/-小鼠右室流出道圓錐部組織異常增生,小梁間囊明顯,結(jié)構(gòu)排列紊亂,流出道狹窄,右室壁心肌致密層的厚度較野生型變薄。Cx43+/-新生鼠心臟無明顯異常。 3.野生型胎鼠心臟近端流出道墊組織于ED11.5開始有融合趨勢,ED13.5完成融合;心肌化過程從ED12.5開始,ED15.5完成。整個心肌化過程呈現(xiàn)心肌由流出道隔外側(cè)向內(nèi)側(cè)延伸的趨勢。而在Cx43-/-胎鼠,α-SCA在近端流出道墊組織的表達(dá)減少,尤其是在ED13.5～15.5為著,說明心肌化過程延遲。Cx43+/-的變化不明顯。 小結(jié) 1.Cx43-/-小鼠以右室流出道異常增生引起的梗阻性畸形為主要表型特征。 2.Cx43-/-小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化遲滯。 第二部分Cx43基因敲除胎鼠心肌化過程中心臟流出道組織基因表達(dá)譜的變化 研究目的 觀察Cx43-/-小鼠胚胎心臟近端流出道組織中基因表達(dá)譜的改變,篩選可能導(dǎo)致Cx43-/-小鼠流出道梗阻的相關(guān)基因。 材料與方法 以ED14.5的Cx43-/-和Cx43+/+胎鼠心臟近端流出道部為研究材料,分別提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;并在體外轉(zhuǎn)錄為cRNA,同時進(jìn)行生物素標(biāo)記及片段化;再與Afymetrix 430 2.0基因芯片進(jìn)行雜交。雜交信號經(jīng)掃描后,應(yīng)用相關(guān)生物信息軟件分析基因表達(dá)情況。 結(jié)果 1.與Cx43+/+組相比較,Cx43-/-組中表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因共有143個,表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有235個。其中表達(dá)差異的基因參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期等主要生理過程。 2.進(jìn)一步篩查發(fā)現(xiàn),TGFβ/BMP信號通路上的5個基因以及Ssr1,Ptk2,Bmp6等與心肌化過程相關(guān)的3個基因在Cx43-/-組有明顯變化。 小結(jié) 1.Cx43基因敲除后可以引起多個基因的表達(dá)異常,其中包括與流出道發(fā)育密切相關(guān)的一些基因。 2.Cx43-/-胎鼠心臟流出道組織中TGFβ/BMP信號通路RhoA,TGFβ2,Smad6,Bmp2,及Bmpr2等基因以及與心肌化過程相關(guān)的Ssr1,Ptk2,Bmp6等基因的差異表達(dá)可能與其流出道梗阻的發(fā)生相關(guān)。 第三部分Realtime RT-PCR驗證關(guān)鍵基因的差異表達(dá) 研究目的 對第二部分篩選出TGFβ/BMP信號通路RhoA,TGFβ2,Smad6,Bmp2及Bmpr2等5個基因以及與心肌化過程相關(guān)的Ssr1,Ptk2,Bmp6等3個基因在內(nèi)的共8個關(guān)鍵基因進(jìn)行Realtime RT-PCR驗證,驗證其變化趨勢是否與基因芯片結(jié)果相同。 材料及方法 以ED14.5的Cx43-/-和Cx43+/+胎鼠心臟近端流出道部為研究材料,分別提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;對芯片檢測中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的5個TGFβ/BMP信號通路上的基因以及Ssr1,Ptk2,Bmp6等與心肌化過程相關(guān)的基因,在ED14.5利用Realtime RT-PCR進(jìn)行驗證。 結(jié)果 1.Realtime RT-PCR驗證其中的5個基因包括TGFβ2,Ssr1、RhoA、Bmp6、Ptk2的變化,表達(dá)量明顯上調(diào),表明其變化趨勢基本與基因芯片結(jié)果相同。 2.Realtime RT-PCR驗證其中的3個基因包括Bmpr2、Bmp2、smad6的變化,表達(dá)量明顯下調(diào),表明其變化趨勢基本與基因芯片結(jié)果相同。 小結(jié) 對第二部分篩選出TGFβ/BMP信號通路RhoA,TGFβ2,Smad6,Bmp2及Bmpr2等5個基因以及與心肌化過程相關(guān)的Ssr1,Ptk2,Bmp6等3個基因在內(nèi)的8個關(guān)鍵基因進(jìn)行Realtime RT-PCR驗證,其變化趨勢與基因芯片的結(jié)果一致。 總結(jié) Cx43基因敲除純合子小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化遲滯,提示Cx43在心肌化的發(fā)生過程中起著重要作用。利用基因芯片技術(shù)初步篩選出與Cx43-/-胎鼠TGFβ/BMP信號通路上的5個基因以及Ssr1,Ptk2,Bmp6等與心肌化過程相關(guān)的多個基因差異表達(dá),并行Realtime RT-PCR驗證。這些關(guān)鍵基因的表達(dá)異常可能與Cx43-/-小鼠心臟流出道梗阻的發(fā)生有關(guān)。
【圖文】：

四、Cx43一八胎鼠心臟流出道組織中差異表達(dá)的關(guān)鍵基因的熒光定量PCR驗證對基因芯片所篩選出的表達(dá)差異的關(guān)鍵基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證，，驗證結(jié)果與芯片篩查的結(jié)果一致，具體變化趨勢見表3一1及圖3一4。攀O·8泰。.。二二_.“..-.一 一一 一一「「一 一一 一冬冬冬 冬鑫 鑫 ttt一 一 一一 ttttttttttt....... .................矜 矜 矜 ttttttttttttttttttttttt爵 爵 爵 爵 爵 爵 爵爵 }}}}} TGFp2RhoABmPrZ口Cx4;弘/十.Cx43一/- BmPZSmad6BmP6SsrlPtkZ各基因名稱圖3一4熒光定量PCR驗證關(guān)鍵基因表達(dá)差異倍數(shù)(En145兩組間相比較
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R725.4

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本文編號：2628243