【摘要】： 背景和目的 先天性腎積水是小兒外科常見畸形,約占新生兒的1%-2%,是兒童終末型腎功能衰竭的重要原因。腎盂輸尿管連接部梗阻(ureteropelvic junction obstruction, UPJO)是導致新生兒非生理性腎積水最常見的原因,約占兒童腎積水的10%,而且梗阻大部分為先天性不完全梗阻。尿液濃縮能力下降是積水腎臟早期的功能變化。積水腎臟尿液濃縮和排泄功能變化的分子生物學機制目前仍不完全清楚。Agre和其同事在90年代發(fā)現(xiàn)水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)后,腎臟濃縮功能機理研究在分子水平上獲得了重大進展。 目前發(fā)現(xiàn)的13種水通道蛋白中分布于腎臟的有7種,主要分布在腎小球、近端小管、集合管和髓袢降支。其中現(xiàn)已明確AQP1-4是腎臟重吸收水濃縮尿液,從而維持機體水平衡的主要分子基礎。為進一步揭示生理狀態(tài)體液代謝平衡和病理狀態(tài)下體液紊亂機制和尋找治療及預防措施提供了較大幫助。研究表明,AQP1主要表達在腎單位的近端小管和髓袢下降支細段上皮細胞的頂質(zhì)膜,而基側(cè)膜則表達較少。AQP2是腎集合管柱狀上皮細胞內(nèi)最重要的水通道蛋白,是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一在細胞內(nèi)分布受激素調(diào)控的水通道蛋白。AQP3位于集合管主細胞的基底膜和兩側(cè)膜上,在連接管也有大量的AQP3分布,AQP3既受加壓素的調(diào)節(jié),也受醛固酮調(diào)節(jié)。AQP4主要位于大鼠腎臟內(nèi)髓集合管基底側(cè)質(zhì)膜上,可能參與集合管水分重吸收和尿液濃縮,但在近端小管S3節(jié)段基底側(cè)質(zhì)膜上也有表達。 動物研究顯示積水腎臟尿液濃縮及稀釋功能的變化與AQPs的表達異常有關。雙側(cè)輸尿管梗阻24h顯著影響腎臟AQP1在近端小管和AQP2-4在集合管的表達,使其表達明顯下調(diào)。該變化可能對雙側(cè)輸尿管梗阻后水分重吸收障礙并引發(fā)低滲性多尿的病理生理過程起重要作用。單側(cè)輸尿管梗阻24h也可造成腎臟AQP1-4表達下調(diào)。AQPs的表達下降可能對單側(cè)梗阻后水分重吸收障礙并引發(fā)低滲性多尿的病理生理過程起重要作用。上述研究結(jié)果均來自動物實驗。目前,國內(nèi)外文獻對人類積水腎臟中AQP1-4的研究至今未見報道。對兒童積水腎臟中AQP1-4的研究無疑將有助于揭示小兒腎積水濃縮稀釋功能變化的機制。 有關AQP1-4 mRNA和蛋白表達與UPJO患兒積水腎臟超聲形態(tài)、排泄功能、病理組織學改變和腎小球濾過率(glomerular filtration rate, GFR)之間關系尚不清楚,而了解這些是臨床醫(yī)生面臨的重要課題。因此本研究目的為：①觀察人類先天性積水腎臟中AQP1-4 mRNA和蛋白的表達與B超分類和靜脈腎盂造影分類不同積水程度之間的關系；②觀察不同病理組織學改變的小兒先天性積水腎臟組織中AQP1-4 mRNA和蛋白的表達情況；③觀察先天性積水腎臟中AQP1-4蛋白的表達與腎實質(zhì)厚度變化和腎小球濾過率變化之間的關系。 1.收集22例接受腎盂成形術(shù)和腎造瘺術(shù),經(jīng)手術(shù)后病理證實的先天性UPJO腎臟標本(男15例,女7例,年齡58.9±54.3月)。病變部位均為單側(cè),其中右側(cè)15例,左側(cè)7例。正常腎臟組織8例(男5例,女3例,年齡58.0±37.7月)來自小兒外科行腎切除術(shù)的經(jīng)手術(shù)后病理證實的腎母細胞瘤癌旁的正常腎組織。 2.按照國際胎兒協(xié)會制定的根據(jù)腎實質(zhì)厚度和腎盂腎盞擴張超聲表現(xiàn)的分級標準將上述患兒分為Ⅲ級腎積水(輕度腎積水組)和Ⅳ級腎積水(重度腎積水組)。其中Ⅲ級腎積水8例,Ⅳ級腎積水14例。 3.按照靜脈腎盂造影(Intravenous Pyelography, IVP)顯影時間的長短將上述患兒分為兩組。輕度腎積水組(10例；IVP 60min內(nèi)腎盂腎盞顯影)和重度腎積水組(12例；IVP 60min內(nèi)腎盂腎盞不顯影)。 4.利用免疫組織化學技術(shù)檢測所有積水腎臟和正常腎臟標本中AQP 1-4在正常腎臟和積水腎臟中的表達與定位。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分別檢測AQP1-4 mRNA在所有積水腎臟和正常腎臟標本中的表達水平。蛋白免疫印跡法(Western Blot)分別檢測AQP1-4蛋白在所有積水腎臟和正常腎臟標本中的表達水平。 5.統(tǒng)計學處理：應用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量資料采用均數(shù)±標準差表示；所有數(shù)值均近似正態(tài)分布,兩組均數(shù)之間的比較用獨立樣本的t檢驗(t-test),三組及三組以上均數(shù)的比較用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗水準為P=0.05。 結(jié)果 1.免疫組織化學檢測結(jié)果顯示：AQP1陽性著色主要分布在腎近曲小管的上皮細胞和髓袢降支細段上皮細胞胞質(zhì),以及腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)。AQP2陽性著色主要分布在腎集合管主細胞胞膜和胞質(zhì)。AQP3陽性著色主要分布在腎集合管主細胞基底側(cè)膜。AQP4陽性著色主要分布在腎內(nèi)髓集合管主細胞基底側(cè)膜。與正常腎臟組織中AQP1-4的表達強度相比,積水程度越重的腎臟組織中AQPl-4的陽性表達強度越弱。 2.RT-PCR結(jié)果顯示B超分類腎積水的重度腎積水組中AQP1-4 mRNA的相對表達量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP1：0.237±0.154 Vs.0.624±0.084 Vs.0.858±0.122；AQP2：0.283±0.124 Vs.0.583±0.112 Vs.0.976±0.134;AQP3：0.460±0.146 Vs.0.760±0.066 Vs.1.006±0.084；AQP4：0.196±0.124 Vs.0.439±0.076 Vs.0.739±0.201；P0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示IVP分類腎積水的重度腎積水組中AQP1-4 mRNA的相對表達量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP 1：0.194±0.118 Vs.0.598±0.092 Vs.0.858±0.122；AQP2：0.247±0.089 Vs.0.566±0.105 Vs.0.976±0.134；AQP3：0.426±0.126 Vs.0.741±0.074 Vs.1.006±0.084；AQP4：0.171±0.115 Vs.0.420±0.081 Vs.0.739±0.201;P0.01)。 3.Western Blot結(jié)果顯示B超分類腎積水的重度腎積水組中AQP1-4蛋白的相對表達量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP1：0.349±0.096 Vs.0.705±0.059 Vs.0.895±0.040；AQP2：0.242±0.113 Vs.0.609±0.037 Vs.0.868±0.084；AQP3：0.195±0.133 Vs.0.575±0.050 Vs.0.806±0.076；AQP4：0.241±0.067 Vs.0.598±0.074 Vs.0.809±0.079；P0.01)。Western Blot結(jié)果顯示IVP分類腎積水的重度腎積水組中AQP1-4蛋白的相對表達量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP 1：0.343±0.099 Vs.0.692±0.062 Vs.0.895±0.040；AQP2：0.217±0.126 Vs.0.567±0.069 Vs.0.868±0.084；AQP3：0.171±0.127 Vs.0.543±0.082 Vs.0.806±0.076；AQP4：0.225±0.063 Vs.0.537±0.078 Vs.0.809±0.079；P0.01)。 1.收集26例接受腎盂成形術(shù)和腎造瘺術(shù),經(jīng)手術(shù)后病理證實的先天性UPJO腎臟標本(男17例,女9例,年齡55.9±49.5月)。病變部位均為單側(cè),其中右側(cè)15例,左側(cè)11例。正常腎臟組織10例(男6例,女4例,年齡63.7±36.8月)來自小兒外科行腎切除術(shù)的經(jīng)手術(shù)后病理證實的腎母細胞瘤癌旁的正常腎組織。 2.將上述患兒根據(jù)其積水腎臟的病理組織學變化將其分為病理學分級Ⅱ-Ⅲ級組,即輕度腎積水組(12例),和病理學分級Ⅳ-Ⅴ級組,即重度腎積水組(14例)。 3.利用免疫組織化學技術(shù)檢測所有積水腎臟和正常腎臟標本中AQP1-4在正常腎臟和積水腎臟中的表達與定位。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分別檢測AQP1-4 mRNA在所有積水腎臟和正常腎臟標本中的表達水平。蛋白免疫印跡法(Western Blot)分別檢測AQP1-4蛋白在所有積水腎臟和正常腎臟標本中的表達水平。 4.統(tǒng)計學處理：應用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量資料采用均數(shù)±標準差表示；所有數(shù)值均近似正態(tài)分布,兩組均數(shù)之間的比較用獨立樣本的t檢驗(t-test),三組及三組以上均數(shù)的比較用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗水準為P=0.05。 結(jié)果 1.免疫組織化學檢測結(jié)果顯示與第一部分中AQP1-4的免疫組化檢測結(jié)果保持一致。 2.RT-PCR結(jié)果顯示病理學分級Ⅳ-Ⅴ級組,即重度腎積水組中AQP1-4mRNA的相對表達量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP1：0.154±0.12 Vs.0.618±0.10 Vs.0.858±0.12；AQP2：0.229±0.11 Vs.0.535±0.12 Vs.0.946±0.14；AQP3：0.402±0.15 Vs.0.7244±0.08 Vs.0.978±0.10;AQP4：0.169±0.11 Vs.0.423±0.08 Vs.0.756±0.18;P0.01)。 3.Western Blot結(jié)果顯示病理學分級Ⅳ-Ⅴ級組,即重度腎積水組中AQP1-4蛋白的相對表達量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP1：0.335±0.096 Vs.0.697±0.057 Vs.0.878±0.051;AQP2：0.195±0.133 Vs.0.569±0.069 Vs.0.816±0.072；AQP3：0.229±0.104 Vs.0.553±0.089 Vs.0.797±0.081;AQP4：0.241±0.067 Vs.0.528±0.084 Vs.0.833±0.104；P0.01)。 材料與方法 1.收集10例接受腎盂成形術(shù)和腎造瘺術(shù),經(jīng)手術(shù)后病理證實的先天性UPJO腎臟標本(男6例,女4例,年齡62.3±18.3月)。病變部位均為左側(cè)。正常腎臟組織6例(男4例,女2例,年齡62.7±17.1月)來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院小兒外科行腎切除術(shù)的經(jīng)手術(shù)后病理證實的腎母細胞瘤癌旁的正常腎組織。 2.10例患兒均接受B超檢測來驗證腎實質(zhì)厚度,同時接受核素99mTc-DTPA腎動態(tài)顯像對患側(cè)腎臟GFR進行評估。手術(shù)過程中對腎積水程度進行再次評估,重點觀察腎實質(zhì)厚度。 3.利用蛋白免疫印跡法(Western Blot)分別檢測AQP1-4蛋白在所有積水腎臟和正常腎臟標本中的表達水平。 4.統(tǒng)計學處理：應用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量資料采用均數(shù)±標準差表示；所有數(shù)值均近似正態(tài)分布,兩組均數(shù)之間的比較用獨立樣本的t檢驗(t-test)。積水腎臟中AQP1-4蛋白的相對表達量與99mTc-DTPA測定的GFR,以及積水腎臟腎實質(zhì)厚度之間進行Pearson相關分析檢驗是否具有相關性,r值為Pearson相關系數(shù)。雙側(cè)P0.05時認為有顯著性差異。 結(jié)果 1.Western Blot結(jié)果顯示正常腎臟組織中AQP1-4蛋白相對表達量分別為0.744±0.21、0.844±0.19、0.82±0.20和0.82±0.14,先天性積水腎臟組織中AQP1-4的相對表達量分別為0.40±0.14、0.48±0.18、0.47±0.21和0.55±0.22。正常腎組織中AQP1-4蛋白相對表達均明顯高于腎積水組(P0.05)。 2.先天性腎積水患兒術(shù)前測量患側(cè)腎臟腎實質(zhì)厚度為1.8-8.5mm,平均為4.59±2.25mm。99mTc-DTPA測定患兒患側(cè)腎臟GFR為24.01-56.65ml/min,平均為39.93±11.52ml/min。對側(cè)腎臟GFR為84.08-118.09ml/min,平均為105.36±20.38ml/min�；紓�(cè)腎臟GFR較對側(cè)腎臟明顯下降(P0.05)。 3.積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達量與積水側(cè)腎臟腎實質(zhì)厚度之間的相關性分析結(jié)果顯示AQP1-4蛋白相對表達量與積水側(cè)腎臟腎實質(zhì)厚度之間的相關性系數(shù)r分別為0.754、0.724、0.726和0.716。P值分別為0.012、0.018、0.017和0.02,均0.05,說明積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達量與腎實質(zhì)厚度之間呈正相關。積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達量與積水側(cè)腎臟GFR之間的相關性分析結(jié)果顯示AQP1-4蛋白相對表達量與積水側(cè)腎臟GFR之間的相關性系數(shù)r分別為0.690、0.705、0.691和0.750。P值分別為0.027、0.023、0.027和0.012,均0.05,說明積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達量與患側(cè)腎臟GFR之間呈正相關。積水側(cè)腎臟腎實質(zhì)厚度與積水側(cè)腎臟GFR之間的相關性分析結(jié)果顯示積水側(cè)腎臟腎實質(zhì)厚度與積水側(cè)腎臟GFR之間的相關性系數(shù)r=0.728,P值為0.017,P0.05,說明積水側(cè)腎臟腎實質(zhì)厚度與GFR之間呈正相關。 結(jié)論 通過上述三部分的研究得出以下結(jié)論。 1.AQP1-4 mRNA和蛋白的表達在先天性積水腎臟中呈低表達,并且隨著積水程度的加重,AQP1-4 mRNA和蛋白的表達越來越低。這提示在人類先天性積水腎臟中AQP1-4 mRNA和蛋白的表達量的降低與超聲分級的腎積水程度的加重成一定的比例,AQP1-4的表達降低可能是引起積水腎臟形態(tài)功能改變的早期因素之一。 2AQP1-4 mRNA和蛋白在IVP不顯影積水腎臟中的表達明顯下降。這提示AQP1-4在先天性積水腎臟中的表達降低,且隨著IVP顯影情況的不同而出現(xiàn)明顯變化,表明AQP1-4在腎積水發(fā)展進程中可能與腎臟分泌功能的下降有一定的關系。 3.小兒先天性積水腎臟中AQP1-4 mRNA和蛋白表達均下調(diào),且隨著積水腎臟病理改變的嚴重程度而變化。提示AQP1-4表達水平的變化可能在先天性腎積水的病理發(fā)展過程中發(fā)揮著一定的作用。 4.積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達量與腎實質(zhì)厚度、腎臟GFR之間呈正相關。這提示AQP1-4蛋白表達量下降與積水腎實質(zhì)厚度和積水腎臟GFR的變化有一定的相關性,為進一步了解腎實質(zhì)厚度越薄腎臟尿液濃縮稀釋功能越差現(xiàn)象的機理研究提供了客觀依據(jù)。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R726.9

【引證文獻】

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1 林曾萍;變應性鼻炎小鼠模型建立及鼻粘膜水通道蛋白5的表達及意義[D];遵義醫(yī)學院;2014年

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本文編號：2627335