【摘要】： 背景:手足口病(Hand-foot-mouth disease ,HFMD)是由多種腸道病毒引起的一種常見傳染病,多發(fā)于5歲以下兒童,特別是3歲以下嬰幼兒,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多種腸道病毒可以引起該病,其病原主要為EV71、A組柯薩奇病毒和�？刹《镜饶c道病毒。近年來我國部分地區(qū)以EV71為主要病原,其神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥引人關(guān)注。重慶地區(qū)2008、2009年均出現(xiàn)手足口病流行,本課題前期曾對2009年本地區(qū)77例手足口病病原檢測顯示41例(53%)EV71陽性,6例(8%)CA16陽性,7例(8%)EV71和CA16均陽性,說明EV71為重慶地區(qū)手足口病的主要病原。 目的:對2009年重慶地區(qū)手足口病患兒臨床標(biāo)本的EV71進(jìn)行分離鑒定及全基因組序列測定,并同國內(nèi)外相關(guān)EV71毒株序列進(jìn)行同源性比對及進(jìn)化分析,以了解重慶地區(qū)EV71流行株基因組序列特征及可能的傳播來源。 方法:(1)采集47例手足口病患兒腦脊液、皰疹液、糞便、咽拭子、肛拭子標(biāo)本共100份,接種于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(Human Rhabdomyosarcoma,RD)中進(jìn)行病毒分離培養(yǎng),對出現(xiàn)細(xì)胞病變(Cytopathic Effect,CPE)的細(xì)胞上清,分別用腸道病毒通用引物、EV71屬特異性引物和柯薩奇A16屬特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測,并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收克隆測序鑒定,將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast分析,同時(shí)用生物學(xué)軟件Bioedit同國際標(biāo)準(zhǔn)BrCr株進(jìn)行序列比對及同源性分析,同時(shí)電鏡觀察引起細(xì)胞病變的病毒形態(tài),以確定所分離的腸道病毒(enteroviruses,EV)的病原EV71。 (2)將鑒定后的2009年重慶地區(qū)EV71流行株基因組分4個(gè)片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行基因測序,測序結(jié)果拼接成全長基因組序列,利用生物信息學(xué)軟件對2009年重慶地區(qū)EV71流行株序列進(jìn)行核苷酸、氨基酸比對分析,分析基因亞型并繪制進(jìn)化樹,以鑒定毒株遺傳流行變異情況及可能的傳播來源。 結(jié)果:(1)47例HFMD患兒的100份臨床標(biāo)本接種RD細(xì)胞培養(yǎng)中,有7份觀察到明顯的細(xì)胞病變,通過RT-PCR檢測有4份呈EV通用引物陽性,有3份EV特異性引物及EV71特異性引物均陽性,而所有標(biāo)本CA16特異性引物檢測均為陰性,EV71特異性引物PCR產(chǎn)物測序結(jié)果證實(shí)為EV71病毒,同時(shí)用電鏡觀察形態(tài)病毒感染的RD細(xì)胞,為20~30nm的圓形無包膜病毒顆粒,與已報(bào)道典型的EV71形態(tài)相同,證實(shí)所分離病毒為EV71。(2)測序獲得的3株重慶地區(qū)EV71流行株病毒基因組全長分別為7409nt、7406nt和7404nt,3株間VP1氨基酸序列同源性達(dá)99%以上,Blast分析表明Chongqing2-09-China(GQ994990.1)、Chongqing-3-09-China(GQ994991.1)均與安徽阜陽2008年分離的3株EV71毒株同源性最高,達(dá)97% ; Chongqing-1-09-China (GQ994989.1)與2005年臺(tái)灣分離的984 polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高,達(dá)96%。3株EV71的VP1氨基酸序列與國內(nèi)C4亞型代表株AF302996(SHZH98)同源性高達(dá)91%以上,證明為C4基因亞型,同時(shí)進(jìn)化樹分析也顯示其屬于C4基因亞型。 結(jié)論:(1)本研究成功分離2009年重慶地區(qū)EV71流行株。 (2)本實(shí)驗(yàn)獲得的3株重慶地區(qū)EV71病毒基因亞型是C4。
【圖文】：

圖 3. EV71 的結(jié)構(gòu)示意圖Figure 3. The structure diagram of EV71齡均可感染，成人和大年齡兒童主要為隱性感染，，發(fā)病癥感染多見于嬰幼兒。無疫苗、藥物等特異性的防控手感染和輕癥病例多，傳染源難以發(fā)現(xiàn)和控制，傳播途徑了解重慶地區(qū) 2009 年 EV71 流行株的特點(diǎn)，為重慶地區(qū)流行病監(jiān)控資料。本研究共收集 2009 年手足口病臨床標(biāo)分離及鑒定，以明確本地區(qū) EV71 流行株的特點(diǎn)。法

A出現(xiàn)細(xì)胞病變，說明分離到病毒。在倒置顯微鏡下與正常RD細(xì)胞比較，特點(diǎn)為細(xì)胞變圓脫落。經(jīng)傳代后上述細(xì)胞病變24h持續(xù)出現(xiàn)，提示得到純化病毒株（圖4）。。2.2 采用腸道病毒通用引物、CA16 特異性引物及 EV71 特異性引物RT-PCR 檢測分離出的病毒對7株引起細(xì)胞病變的陽性毒株采用腸道病毒通用引物及CA16 、EV71 特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，其中3株陽性毒株檢測出EV71病毒的226 bp特異核酸片段及116 bp EV特異性核酸片段（見圖A），另外4株陽性毒株檢出116 bp EV特異性核酸片段（見圖B）。圖5 EV、EV71及CA16特異引物的擴(kuò)增結(jié)果Figure 5 The results for PCR amplification by using enterovirus universalprimers and CA16、EV71-specific primersM DL2000 Marker;A、B中1-5分別為EV擴(kuò)增結(jié)果，A圖中1為已分離EV71陽性對照，2-4為本次分離陽性EV71株；5為水對照；6-10依次為本次分離陽性樣本EV71擴(kuò)增結(jié)果，11-15為CA16引物擴(kuò)增結(jié)果，B圖中2-5為本次分離EV陽性株擴(kuò)增結(jié)果，1為水對照。A:正常的 RD 細(xì)胞（對照）；B：病毒感染的 RD 細(xì)胞圖 4：病毒感染及未感染的 RD 細(xì)胞（×200）Figure 4: Virus infection RD cells and uninfected RD cells (× 200)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R725.1

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馬元鵬;段廣才;范張潔;張衛(wèi)東;郗園林;;2010年鄭州腸道病毒71型VP1基因和5’非編碼區(qū)核酸序列分析[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2012年21期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 馬元鵬;腸道病毒71型VP1基因和5’非編碼區(qū)核酸序列分析[D];鄭州大學(xué);2011年

本文編號：2626695