【摘要】：研究背景 新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)系圍生期窒息，缺氧所致的嚴(yán)重并發(fā)癥，是引起智力落后和腦性癱瘓的主要原因之一。因此對于HIE發(fā)病機(jī)制及治療研究至關(guān)重要。目前對其發(fā)病機(jī)制的分子生物學(xué)研究表明，缺氧缺血性腦損傷是多種因素介導(dǎo)和參與的分子病理過程，諸多因素在病變發(fā)生和發(fā)展中起不同作用。近年對血紅素氧化酶及其催化血紅素產(chǎn)生的內(nèi)源性一氧化碳在HIE發(fā)病機(jī)制中的作用研究日益受到重視。最近研究表明，血紅素氧化酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)是血紅素降解的起始酶和限速酶，催化分解血紅素產(chǎn)生膽綠素、鐵離子和一氧化碳(CO)，是缺氧缺血過程中變化敏感指標(biāo)；細(xì)胞凋亡是缺氧缺血性腦損傷(Hypoxicischemic brain damage，HIBD)后細(xì)胞死亡的主要形式，在輕度缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)元丟失起主要作用，但HO-1在HIBD中的作用及HO-1與腦細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚不明確。本研究采用原位雜交，免疫組化及原位切口末端標(biāo)記的方法來研究HO-1在HIBD后不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)的表達(dá)變化規(guī)律，檢測細(xì)胞凋亡，從而探討HO-1在缺氧缺血性腦損傷中的作用和腦細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制，為研究HIE發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供理論依據(jù)。 第四軍醫(yī)人學(xué)碩卜學(xué)位論文 日的研究新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后海馬區(qū)血紅索 氧化酶一1的表達(dá)變化;檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。從而探討 血紅素氧化酶一1與新/l泣兒缺氧缺血性腦病發(fā)病的關(guān)系:一孚求臨床 治療Il]E新途徑。 方法(l)動物模型的制備:七日齡SD仔鼠72只，隨 機(jī)分為日IBD組和假手術(shù)對照組，!一川犯組分別結(jié)扎右側(cè)預(yù)總動脈， 以1一2升/分的速度輸入含8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，持續(xù) 2小時(shí)，建立HIBO的動物模型;假手術(shù)對照組僅游離而不結(jié)扎動 脈，不進(jìn)行缺氧處理。(2)實(shí)驗(yàn)標(biāo)木制備:兩組動物分別在不同 的時(shí)間點(diǎn)取腦組織標(biāo)本制作石蠟切片。(3)應(yīng)用蘇木索一伊紅染色 觀察海馬區(qū)腦組織病理形態(tài)損傷;分別采用原位雜交、SABC免疫 組化染色研究HO一lmRNA和蛋白表達(dá);原位切口木端標(biāo)記的方法檢 測海馬區(qū)凋一亡細(xì)胞。(4)于400倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野平均陽性 細(xì)胞數(shù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(萬士s)表示，統(tǒng)一計(jì)處尸U采川 51〕55 10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。 結(jié)果 1.光鏡下腦組織海馬區(qū)的病理改變:(1)假手術(shù)對!獄組在 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織切片染色未見明顯缺氧缺血表現(xiàn)。(2)l IIBI)組 右側(cè)海馬在缺氧缺血后即刻無明顯損傷性改變;12小時(shí)可見少量 神經(jīng)細(xì)胞腫脹，細(xì)胞淡染，神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量略有減少;銘小時(shí)除 可見上述變化外，還可見部分壞死細(xì)胞，細(xì)胞松散間隙J)、‘大，細(xì) 胞核濃縮，碎裂結(jié)構(gòu)消失，錐體細(xì)胞嗜伊紅染色;72小時(shí)__L述現(xiàn) 象進(jìn)一步加劇，海馬CAI區(qū)神經(jīng)元大多數(shù)壞死，嗜伊紅深染，周 邊有膠質(zhì)細(xì)胞增生，同時(shí)可見少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，深染。 2.110--lml褚NA基因轉(zhuǎn)錄情況:(l)110一lmRNAI淚性細(xì)胞的形態(tài) 及分布:成熟HO一lmRNA主要分布在細(xì)胞漿中，細(xì)胞核中亦有少量 的”于lmRNA前體。mRNA與地高辛標(biāo)記的寡核營酸探針結(jié)合后， 用DAB顯色，細(xì)胞漿及核膜呈棕黃色。假手術(shù)對照組mRNA含 第四軍醫(yī)大學(xué)碩!:學(xué)位論文 量低，_且不同的細(xì)胞含量有所不同，故原位雜交后顯色深淺不一 致;HIBD組右側(cè)海馬HO一lmRNA轉(zhuǎn)錄明顯增加，以CAI，CA3 的神經(jīng)元及齒狀回的顆粒細(xì)胞為主，少量膠質(zhì)細(xì)胞也著色，.且大 多數(shù)紅”胞核著色，分布密集。(2)不同時(shí)問點(diǎn)HO一lmRNA檢測 比較:假手術(shù)對照組各時(shí)間點(diǎn)HO一lmRNA陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差 異;HIBD組與假手術(shù)對照組在不同的時(shí)間點(diǎn)HO一lmRNA轉(zhuǎn)錄差 異有顯著意義，HIBD組右側(cè)海馬O小時(shí)HO一lmRNA轉(zhuǎn)錄與對照 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0 .05)，4小時(shí)表達(dá)開始增加(52.8士6.1) (P0.01)，12小時(shí)達(dá)高峰(55.7士6.4)(P0.01)，，72小I月‘有所下降 (52.3士5.2)(p0.01)，但仍高于假手術(shù)對照組(25.0士5.1)。 3.HO一1蛋白表達(dá)情況:HO一1主要分布在核膜和胞漿中， 與HO一1多抗結(jié)合后，經(jīng)過DAB染色，使核膜和胞漿呈棕黃色。 假手術(shù)對照組陽性細(xì)胞少，染色較淺;HIBD組右側(cè)海馬陽性細(xì) 胞明顯增多，染色較深，_目‘不同的時(shí)盯lJ點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)與對照紅L相 比有差異。HIBD組右側(cè)海馬4小11寸HO一l表達(dá)增)J「I(53.2士5.6) (P0.()5)，12小時(shí)‘達(dá)高公帳(10().8士8.7)(P(0.01)，72小l月‘有所 下降(74.0士5.1)，但仍高于假手術(shù)對照組(32.8士6.7)(p0.()l)。 4.細(xì))泡凋亡情況:因發(fā)生凋亡的細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被 激活，細(xì)胞自身染色質(zhì)或DNA被切害U，產(chǎn)生與DNA斷點(diǎn)數(shù)「!相 同的3，一經(jīng)荃末端，與生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶 (Av記in一HRP)結(jié)合后，DAB染色，使細(xì)胞核呈棕黃色。假手術(shù) 對照組陽性細(xì)胞極少，HIBD組右側(cè)海馬12小時(shí)凋亡到11胞數(shù)增加 (19.67士3.39)(p0.01)，24小時(shí)達(dá)高峰(30.17士3.31)(P0.01)， 72小時(shí)凋亡細(xì)胞減少(14.00士2.83)，但仍高于對照組(9 .17士1.47) (P(0 .05)。 結(jié)論 1.正常新生大鼠海馬區(qū)有少量HO一1mRNA轉(zhuǎn)錄，F(xiàn)llBD后 H于lmRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯增高。 第四軍醫(yī)人學(xué)碩卜學(xué)位論文 正常新生大鼠海馬區(qū)有少量110一l蛋白的表達(dá)，川BD 后110一1蛋
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R722.12

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2623623