【摘要】： 目的:在膽汁淤積性肝病中,疏水性膽汁酸在肝臟內(nèi)的蓄積被認(rèn)為能導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性作用。疏水性膽汁酸通過致肝線粒體活性氧(ROS)產(chǎn)生和膜通透性轉(zhuǎn)換(MPT)引發(fā)線粒體功能紊亂,誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、壞死產(chǎn)生毒性作用。本文通過建立疏水性膽汁酸致新鮮離體新生鼠肝線粒體損傷的模型,探討疏水性膽汁酸致新生鼠肝線粒體活性氧產(chǎn)生和膜通透性轉(zhuǎn)換的具體機(jī)制,并進(jìn)一步證明抗氧化和抗MPT處理的臨床價值。 方法:取健康6天齡近交系Wistar大鼠新生鼠,每十只作為一測量單位。采用乙醚麻醉后,剖腹取肝,收集十只肝臟稱重后勻漿,采用差速和密度梯度法分離提純線粒體。于線粒體懸液中加入不同濃度的甘氨鵝脫氧膽酸(GCDC),預(yù)先加入和不加入MPT抑制劑-環(huán)孢菌素A及三種抗氧化劑(褪黑素、β-胡羅卜素和α-生育酚),用分光光度計連續(xù)測量MPT 5分鐘,觀察膽汁酸濃度對MPT的影響,并比較不同預(yù)處理后MPT的改變值。電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變。用流式細(xì)胞儀測定加入GCDC后1,3,5,10分鐘時線粒體ROS的產(chǎn)生量。觀察膽汁酸濃度對ROS產(chǎn)生的影響,比較不同預(yù)處理后ROS的增加量。測量指標(biāo)均取三次測量單位結(jié)果的平均值。 結(jié)果:線粒體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和膜通透性轉(zhuǎn)換與加入膽汁酸的濃度及處理時間呈依賴關(guān)系:隨濃度的升高,時間的延長,線粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生量和膜通透性均增高,電鏡結(jié)果顯示加入膽汁酸后線粒體超微結(jié)構(gòu)的破壞較對照組明顯;抗MPT組線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換明顯抑制,活性氧產(chǎn)生較對照組明顯降低,電鏡結(jié)果顯示抗MPT組較對照組及抗氧化組線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞明顯改善;抗氧化組線粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生較對照組明顯減少,膜通透性轉(zhuǎn)換較對照組明顯抑制,電鏡結(jié)果顯示抗氧化組較對照組線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞明顯改善。 結(jié)論: 1.離體的新生鼠肝線粒體經(jīng)疏水性膽汁酸處理后,能迅速發(fā)生膜通透性轉(zhuǎn)換、活性氧產(chǎn)生和線粒體形態(tài)學(xué)的改變,這些改變同膽汁酸的濃度及處理時間呈劑量、時間依賴關(guān)系。 2.疏水性膽汁酸處理新生鼠肝線粒體后,線粒體活性氧產(chǎn)生與膜通透性轉(zhuǎn)換呈正相關(guān)。 3.抗氧化及抗MPT處理能明顯抑制由疏水性膽汁酸所致新生鼠肝線粒體活性氧產(chǎn)生、膜通透性轉(zhuǎn)換及線粒體形態(tài)學(xué)改變,具有一定的臨床應(yīng)用價值。
【圖文】：

結(jié) 果1．不同濃度的 GCDC 致 MPT 變化與時間的關(guān)系以吸光度的減少量反映線粒體的腫脹程度和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換（MPT）的發(fā)生，間接反映線粒體膜孔(MPTP)的開放程度。不同濃度的 GCDC 均能誘導(dǎo)線粒體在 540nm下的吸光度迅速下降，，表明線粒體的腫脹發(fā)生與疏水性膽汁酸致 MPT 的變化作用有關(guān)。隨著 GCDC 濃度的上升以及反應(yīng)時間的推移，吸光度下降的越明顯，表明線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換的發(fā)生與膽汁酸的濃度以及反應(yīng)時間呈濃度、時間依賴關(guān)系（圖 5）。由 GCDC 引發(fā)線粒體 MPT 的改變及線粒體腫脹能被 5μM CsA（一種 MPT 抑制劑）明顯抑制，當(dāng) GCDC 濃度達(dá)到 400μM 時亦能產(chǎn)生此現(xiàn)象。

3．不同濃度的 GCDC 致線粒體 ROS 產(chǎn)生與時間的關(guān)系以平均熒光強度值代表新生鼠肝線粒體 ROS 產(chǎn)生值，反映線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激程度。不同濃度的 GCDC 均能誘導(dǎo)肝線粒體 ROS 的產(chǎn)生，這表明 GCDC 能誘導(dǎo)新生鼠肝線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生。隨著 GCDC 濃度的上升以及反應(yīng)時間的推移，平均熒光強度上升的越明顯，這表明新生鼠肝線粒體內(nèi) ROS 產(chǎn)生與膽汁酸的濃度以及反應(yīng)時間呈濃度、時間依賴關(guān)系（表 2，圖 7）。同一時間點上，隨著膽汁酸濃度的上升（50-400μM），線粒體內(nèi) ROS 的產(chǎn)生呈上升趨勢。同一膽汁酸濃度條件下，隨著時間的推移（1’-10’）線粒體內(nèi) ROS 的產(chǎn)生亦呈上升趨勢。由 GCDC 引發(fā)線粒體內(nèi) ROS 的生成能被 5μM CsA 所明顯抑制，當(dāng) GCDC濃度達(dá)到 400μM 時亦能產(chǎn)生此現(xiàn)象。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2623576