【摘要】： 前言 Ndrg1(N-myc downstream regulated gene 1)基因定位于8號(hào)染色體，受上游N-Myc基因調(diào)控。目前研究表明，Ndrg1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等多種生物學(xué)功能。各種惡性實(shí)體腫瘤和惡性腫瘤細(xì)胞株Ndrg1表達(dá)水平顯著降低，并與腫瘤分化程度、腫瘤轉(zhuǎn)移能力和臨床預(yù)后密切相關(guān)，已公認(rèn)為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因和抑癌基因，但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于兒童急性白血病Ndrg1表達(dá)情況的臨床研究報(bào)道。 目的 研究?jī)和毙园籽drg1基因表達(dá)情況，分析比較不同危險(xiǎn)度ALL患者單個(gè)核細(xì)胞Ndrg1基因表達(dá)水平，探討Ndrg1表達(dá)水平與ALL臨床預(yù)后和治療反應(yīng)的關(guān)系，為指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 以我院兒童血液腫瘤科2004年6月～2006年12月收治的65例新發(fā)急性白血病患兒為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其中ALL41例，AML24例。對(duì)照組為我院門診常規(guī)體檢兒童，共12名。收集研究對(duì)象骨髓或外周血抗凝標(biāo)本，密度梯度離心法提取制備單個(gè)核細(xì)胞，Trizol試劑提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR。根據(jù)樣本熒光定量PCR動(dòng)力曲線確定目標(biāo)基因Ndrg1和管家基因GAPDH的Ct值，對(duì)照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本Ndrg1和GAPDH基因起始拷貝數(shù)(表達(dá)水平)。以規(guī)一化Ndrg1值([起始拷貝數(shù)_(Ndrg1)／起始拷貝數(shù)_(GAPDH)]×100)判斷Ndrg1基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。 結(jié)果 1、以HL-60細(xì)胞Ndrg1和GAPDH普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10倍梯度稀釋制成的系列標(biāo)準(zhǔn)品為模板行熒光定量PCR，根據(jù)系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品起始拷貝數(shù)和Ct值繪制的Ndrg1和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸系數(shù)分別為0．996和0．999，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度范圍內(nèi)，熒光定量PCR動(dòng)力曲線Ct值與模板起始拷貝數(shù)間具有良好線性關(guān)系，因此可通過(guò)熒光定量PCR在本研究設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下準(zhǔn)確測(cè)定臨床樣本Ndrg1和管家基因GAPDH表達(dá)水平。 2、盡管正常對(duì)照組、ALL組、AML組，以及AL組外周血單個(gè)核細(xì)胞歸一化Ndrg1值的中位數(shù)均高于相應(yīng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞歸一化Ndrg1值的中位數(shù)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，，各組外周血和骨髓單個(gè)核細(xì)胞Ndrg1表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P＞0．05)。 3、AL單個(gè)核細(xì)胞Ndrg1表達(dá)水平(歸一化Ndrg1值的中位數(shù)為0．19)顯著低于對(duì)照組(歸一化Ndrg1值的中位數(shù)為0．41)(P=0．02)。ALL和AML組歸一化Ndrg1的中位數(shù)分別為0．17和0．19，也顯著低于對(duì)照組，但ALL和AML間表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P=0．591)。 4、潑尼松敏感型ALL患兒?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞Ndrg1表達(dá)水平顯著高于潑尼松不敏感型ALL，歸一化Ndrg1值的中位數(shù)分別為0．29和0．15，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異具有顯著性(P=0．022)。 5、標(biāo)危組ALL單個(gè)核細(xì)胞Ndrg1表達(dá)水平顯著高于高危組ALL，兩組歸一化Ndrg1值的中位數(shù)分別為0．25和0．13(P=0．034)。 6、ALL-L3單個(gè)核細(xì)胞Ndrg1表達(dá)水平低于L1和L2，可能與L3白血病細(xì)胞增殖旺盛、臨床進(jìn)展迅猛有關(guān)。 結(jié)論 1、急性白血病患兒?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞Ndrg1表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞，提示Ndrg1作為一種抑癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因在白血病發(fā)生發(fā)展方面可能具有重要作用。 2、研究結(jié)果表明，Ndrg1表達(dá)量與兒童ALL臨床危險(xiǎn)度、潑尼松試驗(yàn)敏感性等預(yù)后因素和治療反應(yīng)密切相關(guān)。潑尼松敏感和低危組ALL患者Ndrg1表達(dá)水平顯著高于潑尼松不敏感者和高危組患者，高度提示Ndrg1是反映ALL預(yù)后和治療反應(yīng)的重要分子生物學(xué)指標(biāo)，在ALL預(yù)后判斷和指導(dǎo)個(gè)體化治療方面可能具有重要應(yīng)用價(jià)值。 3、ALL-L3單個(gè)核細(xì)胞Ndrg1表達(dá)水平顯著低于L1和L2，很可能與L3白血病細(xì)胞增殖能力強(qiáng)、臨床進(jìn)展快有關(guān)。由于Ndrg1具有抑制細(xì)胞分化的作用，而且在細(xì)胞周期S期表達(dá)水平較低，G0和G1期表達(dá)較高，推測(cè)目前采用烷化劑(細(xì)胞周期非特異性化療藥物)為主的聯(lián)合化療治療L3和Burrkit淋巴瘤療效顯著，可能與L3(Burrkit淋巴瘤)Ndrg1低表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

以前列腺癌細(xì)胞株(PC一3)為陽(yáng)性對(duì)照，采用常規(guī)PCR鑒定Ndrgl擴(kuò)增產(chǎn)物。同時(shí)各檢測(cè)1例ALL和AML患者骨髓和1例對(duì)照兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞Ndrgl擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。正�？瞻�250bP100bP圖1常規(guī)PcR助KGI的表達(dá)結(jié)果從上圖可見(jiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后于98匕p處見(jiàn)單一清晰的擴(kuò)增條帶，表明引物設(shè)計(jì)正確合理。二、Ndrgl和GAPDH基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立l、Ndrgl基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以Ndrgl標(biāo)準(zhǔn)品起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，擬合Ndrgl熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率k二一3.84，截距b=49.11，直線回歸相關(guān)系數(shù):二0.996(圖2)。

圖2Ndgrl熒光pCR標(biāo)準(zhǔn)曲線2、GAPDH基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，擬GAPDH熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率k=一3.51，截距b=.75，直線回歸相關(guān)系數(shù):=0.999(圖3)。hGAPDH02胡口;roeu，。加t一。t創(chuàng)}附Dx立，.:一3五t*r亡匆龜:叮t44505550665077508
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R733.71

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本文編號(hào)：2618404