【摘要】： 前言 Ndrg1(N-myc downstream regulated gene 1)基因定位于8號染色體，受上游N-Myc基因調控。目前研究表明，Ndrg1具有調節(jié)細胞生長和分化等多種生物學功能。各種惡性實體腫瘤和惡性腫瘤細胞株Ndrg1表達水平顯著降低，并與腫瘤分化程度、腫瘤轉移能力和臨床預后密切相關，已公認為一種腫瘤轉移抑制基因和抑癌基因，但目前國內外尚無關于兒童急性白血病Ndrg1表達情況的臨床研究報道。 目的 研究兒童急性白血病Ndrg1基因表達情況，分析比較不同危險度ALL患者單個核細胞Ndrg1基因表達水平，探討Ndrg1表達水平與ALL臨床預后和治療反應的關系，為指導臨床個體化治療奠定理論基礎。 方法 以我院兒童血液腫瘤科2004年6月～2006年12月收治的65例新發(fā)急性白血病患兒為實驗對象，其中ALL41例，AML24例。對照組為我院門診常規(guī)體檢兒童，共12名。收集研究對象骨髓或外周血抗凝標本，密度梯度離心法提取制備單個核細胞，Trizol試劑提取單個核細胞總RNA，逆轉錄后進行熒光定量PCR。根據(jù)樣本熒光定量PCR動力曲線確定目標基因Ndrg1和管家基因GAPDH的Ct值，對照各自的標準曲線確定樣本Ndrg1和GAPDH基因起始拷貝數(shù)(表達水平)。以規(guī)一化Ndrg1值([起始拷貝數(shù)_(Ndrg1)／起始拷貝數(shù)_(GAPDH)]×100)判斷Ndrg1基因mRNA相對表達水平。 結果 1、以HL-60細胞Ndrg1和GAPDH普通PCR擴增產(chǎn)物10倍梯度稀釋制成的系列標準品為模板行熒光定量PCR，根據(jù)系列稀釋標準品起始拷貝數(shù)和Ct值繪制的Ndrg1和GAPDH的標準曲線的直線回歸系數(shù)分別為0．996和0．999，說明在本實驗設定的標準品稀釋濃度范圍內，熒光定量PCR動力曲線Ct值與模板起始拷貝數(shù)間具有良好線性關系，因此可通過熒光定量PCR在本研究設定的實驗條件下準確測定臨床樣本Ndrg1和管家基因GAPDH表達水平。 2、盡管正常對照組、ALL組、AML組，以及AL組外周血單個核細胞歸一化Ndrg1值的中位數(shù)均高于相應骨髓單個核細胞歸一化Ndrg1值的中位數(shù)，但經(jīng)統(tǒng)計學分析，，各組外周血和骨髓單個核細胞Ndrg1表達水平無顯著性差異(P＞0．05)。 3、AL單個核細胞Ndrg1表達水平(歸一化Ndrg1值的中位數(shù)為0．19)顯著低于對照組(歸一化Ndrg1值的中位數(shù)為0．41)(P=0．02)。ALL和AML組歸一化Ndrg1的中位數(shù)分別為0．17和0．19，也顯著低于對照組，但ALL和AML間表達水平無顯著性差異(P=0．591)。 4、潑尼松敏感型ALL患兒單個核細胞Ndrg1表達水平顯著高于潑尼松不敏感型ALL，歸一化Ndrg1值的中位數(shù)分別為0．29和0．15，經(jīng)統(tǒng)計學比較差異具有顯著性(P=0．022)。 5、標危組ALL單個核細胞Ndrg1表達水平顯著高于高危組ALL，兩組歸一化Ndrg1值的中位數(shù)分別為0．25和0．13(P=0．034)。 6、ALL-L3單個核細胞Ndrg1表達水平低于L1和L2，可能與L3白血病細胞增殖旺盛、臨床進展迅猛有關。 結論 1、急性白血病患兒單個核細胞Ndrg1表達水平顯著低于對照組外周血單個核細胞，提示Ndrg1作為一種抑癌基因和腫瘤轉移抑制基因在白血病發(fā)生發(fā)展方面可能具有重要作用。 2、研究結果表明，Ndrg1表達量與兒童ALL臨床危險度、潑尼松試驗敏感性等預后因素和治療反應密切相關。潑尼松敏感和低危組ALL患者Ndrg1表達水平顯著高于潑尼松不敏感者和高危組患者，高度提示Ndrg1是反映ALL預后和治療反應的重要分子生物學指標，在ALL預后判斷和指導個體化治療方面可能具有重要應用價值。 3、ALL-L3單個核細胞Ndrg1表達水平顯著低于L1和L2，很可能與L3白血病細胞增殖能力強、臨床進展快有關。由于Ndrg1具有抑制細胞分化的作用，而且在細胞周期S期表達水平較低，G0和G1期表達較高，推測目前采用烷化劑(細胞周期非特異性化療藥物)為主的聯(lián)合化療治療L3和Burrkit淋巴瘤療效顯著，可能與L3(Burrkit淋巴瘤)Ndrg1低表達有關。
【圖文】：

以前列腺癌細胞株(PC一3)為陽性對照，采用常規(guī)PCR鑒定Ndrgl擴增產(chǎn)物。同時各檢測1例ALL和AML患者骨髓和1例對照兒童外周血單個核細胞Ndrgl擴增產(chǎn)物(圖1)。正�？瞻�250bP100bP圖1常規(guī)PcR助KGI的表達結果從上圖可見，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后于98匕p處見單一清晰的擴增條帶，表明引物設計正確合理。二、Ndrgl和GAPDH基因熒光定量PCR標準曲線的建立l、Ndrgl基因熒光定量PCR標準曲線的建立以Ndrgl標準品起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標，擬合Ndrgl熒光定量PCR標準曲線。標準曲線斜率k二一3.84，截距b=49.11，直線回歸相關系數(shù):二0.996(圖2)。

圖2Ndgrl熒光pCR標準曲線2、GAPDH基因熒光定量PCR標準曲線的建立以GAPDH標準品起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標，擬GAPDH熒光定量PCR標準曲線。標準曲線斜率k=一3.51，截距b=.75，直線回歸相關系數(shù):=0.999(圖3)。hGAPDH02胡口;roeu，。加t一。t創(chuàng)}附Dx立，.:一3五t*r亡匆龜:叮t44505550665077508
【學位授予單位】：四川大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R733.71

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本文編號：2618404