【摘要】： 膽道閉鎖(biliary atresia, BA)是兒童最常見的嚴(yán)重肝臟疾病,病因至今未明,既往的研究多局限于某些炎癥細(xì)胞或因子在發(fā)病中的作用,但是不同的細(xì)胞與細(xì)胞間,分子與分子間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,這些細(xì)胞和因子哪些處于始動(dòng)環(huán)節(jié),哪些處于核心通路或是相應(yīng)的下游環(huán)節(jié),始終未能闡明。為進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制,本研究借助基因芯片及生物信息學(xué)技術(shù)在全基因組水平對(duì)基因表達(dá)譜及基因間的相互關(guān)系進(jìn)行研究。對(duì)于所得到的關(guān)鍵基因?qū)ζ湓谀懙篱]鎖肝臟中的表達(dá)及突變情況進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)在體外細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)可能存在的關(guān)鍵調(diào)控基因的功能進(jìn)行深入研究。 目的利用基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法對(duì)膽道閉鎖的基因表達(dá)譜進(jìn)行研究,以進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制。 方法Trizol一步法提取膽道閉鎖組及膽總管囊腫組肝臟組織的總RNA,利用人全基因組基因表達(dá)芯片研究膽道閉鎖及膽總管囊腫肝臟組織基因表達(dá)譜間的差異,并對(duì)所得差異基因進(jìn)行表達(dá)趨勢(shì)顯著性及功能分析、信號(hào)傳導(dǎo)通路顯著性分析,并構(gòu)建基因間相互作用網(wǎng)絡(luò),尋找在膽道閉鎖發(fā)病過程中的顯著性的基因表達(dá)趨勢(shì)、信號(hào)通路及關(guān)鍵調(diào)控基因。 結(jié)果膽道閉鎖與膽總管囊腫相比存在1000余條差異基因；通過對(duì)表達(dá)譜芯片所得差異基因的分析,得到： (1)趨勢(shì)21及23兩個(gè)最具顯著性的表達(dá)趨勢(shì)。趨勢(shì)21的基因功能主要涉及組織相容性抗原復(fù)合物Ⅱ介導(dǎo)的外源性抗原呈遞作用以及由此導(dǎo)致的免疫反應(yīng)。趨勢(shì)23的基因功能主要涉及器官組織發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)形成,陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)與磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)。(2)趨勢(shì)21涉及的顯著性通路主要為細(xì)胞凋亡調(diào)控(與炎癥及組織重構(gòu)有關(guān)),細(xì)胞基質(zhì)代謝以及細(xì)胞粘附、花生四烯酸類物質(zhì)的合成(與炎癥反應(yīng)相關(guān))；趨勢(shì)23主要涉及細(xì)胞基質(zhì)代謝(參與組織重構(gòu))、炎癥反應(yīng)、花生四烯酸類物質(zhì)的合成、增殖與遷移能力。 (3)其中趨勢(shì)21的關(guān)鍵基因包括ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19,趨勢(shì)23的關(guān)鍵基因包括LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11。 (4)通過基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)LDOC1基因可能在膽道閉鎖發(fā)病中起關(guān)鍵調(diào)控作用。 結(jié)論 (1)膽道閉鎖的發(fā)病與MHCⅡ類分子介導(dǎo)免疫炎癥及組織重構(gòu)密切相關(guān)。 (2)其中ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19和LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11分別在趨勢(shì)21和趨勢(shì)23中具有重要作用。 (3)LDOC1基因可能在膽道閉鎖發(fā)病過程中起著核心調(diào)控作用。 目的：研究第一部分實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的膽道閉鎖中關(guān)鍵基因的表達(dá)及突變情況,以驗(yàn)證基因芯片結(jié)果并進(jìn)一步揭示該病的發(fā)病機(jī)制。 材料與方法： (1)22例膽道閉鎖患兒和14例膽總管囊腫患兒手術(shù)活檢肝臟標(biāo)本,利用RT-PCR方法對(duì)趨勢(shì)21和趨勢(shì)23所發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSG19和LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11進(jìn)行了半定量檢測(cè)。同時(shí)以Real-time PCR的方法對(duì)LDOC1基因進(jìn)行了定量檢測(cè)。 (2)抽取10例膽道閉鎖患兒外周靜脈血2ML,抽提基因組DNA,對(duì)目的基因ITGB2和LDOC1基因外顯子進(jìn)行擴(kuò)增純化并測(cè)序,了解其突變及SNP改變情況。 結(jié)果： (1)膽道閉鎖肝臟組織中ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSG19、LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11及LDOC1均較膽總管囊腫明顯升高(P0.05)。 (2)對(duì)ITGB2基因16個(gè)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與NCBI參考序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)：9例患兒(9/10)存在ITGB2基因單核苷酸多態(tài)性改變。這些改變包括3個(gè)突變和11個(gè)SNP改變。其中突變分別是N212Y(2/10),Y544H(1/10),P752S(4/10)；SNP改變包括：-156T/C(5/10),117G/A(1/10),919G/A(5/10),1101C/A(4/10),1533C/T(1/10),3’-UTR+123C/T(4/10),3’-UTR+140G/A(4/10),3’-UTR+148C/A(6/10),3’-UTR+170C/T(8/10),3’-UTR+219T/C(1/10),3’-UTR+286C/T(3/10)。LDOC1基因僅有1個(gè)外顯子,與參考序列相比,在3例患兒(3/10)存在單核苷酸多態(tài)性改變。共有1處SNP改變,為3’UTR+822C/T。 結(jié)論 (1)膽道閉鎖中,ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RGS19、LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11、LDOC1等關(guān)鍵基因表達(dá)升高,這些基因的功能主要涉及免疫炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)重建,說明它們可能參與膽道閉鎖炎癥及纖維化的進(jìn)程。 (2)膽道閉鎖中ITGB2基因外顯子區(qū)存在多處突變及單核苷酸改變。LDOC1基因外顯子區(qū)存在1處SNP改變。這些突變可能導(dǎo)致相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)及功能改變,從而參與膽道閉鎖的發(fā)病。而SNP改變的存在,可能與膽道閉鎖的疾病易感性相關(guān)。 目的：體外研究LDOC1基因高表達(dá)對(duì)T淋巴細(xì)胞Thl類炎癥因子表達(dá)的影響。 方法：體外構(gòu)建pIRES2-EGFP-LDOC1質(zhì)粒,將pIRES2-EGFP-LDOC1和空白質(zhì)粒pIRES2-EGFP重組并包裝腺病毒,感染Jurkat細(xì)胞,利用westernblot的方法研究LDOC1蛋白的表達(dá),利用Elisa的方法研究無轉(zhuǎn)染組、pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組和PAd-IRES2-EGFP組細(xì)胞在靜息狀態(tài)和PMA激活狀態(tài)下Thl類炎癥因子TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達(dá)情況。 結(jié)果：成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-LDOC1質(zhì)粒,并利用腺病毒包裝后轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞。轉(zhuǎn)染LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉(zhuǎn)染組(PAd-IRES2-EGFP組),LDOC1蛋白表達(dá)明顯升高。轉(zhuǎn)染LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉(zhuǎn)染組(PAd-IRES2-EGFP組),在靜息狀態(tài)下在炎癥因子產(chǎn)生上并無明顯差異,但在經(jīng)PMA刺激后,LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉(zhuǎn)染組(PAd-IRES2-EGFP組)TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達(dá)均明顯升高,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有顯著性差異(p值分別為0.0099、0.0043和0.0026)。 結(jié)論：在Jurkat細(xì)胞中高表達(dá)LDOC1可以促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-2、IFN-γ表達(dá)升高。而膽道閉鎖中存在LDOC1基因表達(dá)升高,提示其可能對(duì)Thl類細(xì)胞因子表達(dá)具有促進(jìn)作用,從而加劇膽道閉鎖中持續(xù)而炎癥的免疫損傷。
【圖文】：

總RNA電泳圖

利用GBMS生物信息分析平臺(tái)對(duì)獲得的1000余條差異基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到如下結(jié)果:1.顯著性基因表達(dá)趨勢(shì)及功能分析(圖4)Pro栩es“ deredbasedonthe卜vakleslgn欣aneeof側(cè)月油erotg即esass沖隴dversusexPected圈.1圈.惻園團(tuán)口目涵目目日口曰因圈園口翹曰圖日圈曰圖4基因表達(dá)趨勢(shì)(注:每種趨勢(shì)的左上角的數(shù)字為趨勢(shì)編號(hào);左下角值為P值，，如profilezl的顯著性水平P值為1、10一，‘，其中著色部分為顯著性表達(dá)趨勢(shì)，而綠色部分為最具顯著性表達(dá)趨勢(shì)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇最具顯著性的表達(dá)趨勢(shì)21和23進(jìn)行深入分析)經(jīng)過趨勢(shì)分析，我們發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖和膽總管囊腫間存在顯著差異，而膽道閉鎖的三張芯片內(nèi)部并無明顯差異。其中綠色部分的趨勢(shì)21和趨勢(shì)23的基因表達(dá)趨勢(shì)具有最顯著性差異，根據(jù)基因功能分布發(fā)現(xiàn)，趨勢(shì)21主要涉及組織相容性抗原復(fù)合物n介導(dǎo)的外源性抗原呈遞作用以及由此導(dǎo)致的免疫反應(yīng)，該作用主要涉及的細(xì)胞內(nèi)定位為溶酶體。趨勢(shì)23主要涉及器官組織發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)形成，陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)與磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)。這些功能導(dǎo)致了膽道閉鎖與膽總管囊腫的主要差異。2.顯著性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R726.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2612239