【摘要】： 膽道閉鎖(biliary atresia, BA)是兒童最常見的嚴重肝臟疾病,病因至今未明,既往的研究多局限于某些炎癥細胞或因子在發(fā)病中的作用,但是不同的細胞與細胞間,分子與分子間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,這些細胞和因子哪些處于始動環(huán)節(jié),哪些處于核心通路或是相應(yīng)的下游環(huán)節(jié),始終未能闡明。為進一步闡明該病的發(fā)病機制,本研究借助基因芯片及生物信息學(xué)技術(shù)在全基因組水平對基因表達譜及基因間的相互關(guān)系進行研究。對于所得到的關(guān)鍵基因?qū)ζ湓谀懙篱]鎖肝臟中的表達及突變情況進行了驗證。同時在體外細胞培養(yǎng)中對可能存在的關(guān)鍵調(diào)控基因的功能進行深入研究。 目的利用基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法對膽道閉鎖的基因表達譜進行研究,以進一步闡明該病的發(fā)病機制。 方法Trizol一步法提取膽道閉鎖組及膽總管囊腫組肝臟組織的總RNA,利用人全基因組基因表達芯片研究膽道閉鎖及膽總管囊腫肝臟組織基因表達譜間的差異,并對所得差異基因進行表達趨勢顯著性及功能分析、信號傳導(dǎo)通路顯著性分析,并構(gòu)建基因間相互作用網(wǎng)絡(luò),尋找在膽道閉鎖發(fā)病過程中的顯著性的基因表達趨勢、信號通路及關(guān)鍵調(diào)控基因。 結(jié)果膽道閉鎖與膽總管囊腫相比存在1000余條差異基因；通過對表達譜芯片所得差異基因的分析,得到： (1)趨勢21及23兩個最具顯著性的表達趨勢。趨勢21的基因功能主要涉及組織相容性抗原復(fù)合物Ⅱ介導(dǎo)的外源性抗原呈遞作用以及由此導(dǎo)致的免疫反應(yīng)。趨勢23的基因功能主要涉及器官組織發(fā)育、細胞外基質(zhì)形成,陰離子轉(zhuǎn)運與磷酸基團轉(zhuǎn)運。(2)趨勢21涉及的顯著性通路主要為細胞凋亡調(diào)控(與炎癥及組織重構(gòu)有關(guān)),細胞基質(zhì)代謝以及細胞粘附、花生四烯酸類物質(zhì)的合成(與炎癥反應(yīng)相關(guān))；趨勢23主要涉及細胞基質(zhì)代謝(參與組織重構(gòu))、炎癥反應(yīng)、花生四烯酸類物質(zhì)的合成、增殖與遷移能力。 (3)其中趨勢21的關(guān)鍵基因包括ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19,趨勢23的關(guān)鍵基因包括LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11。 (4)通過基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)LDOC1基因可能在膽道閉鎖發(fā)病中起關(guān)鍵調(diào)控作用。 結(jié)論 (1)膽道閉鎖的發(fā)病與MHCⅡ類分子介導(dǎo)免疫炎癥及組織重構(gòu)密切相關(guān)。 (2)其中ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19和LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11分別在趨勢21和趨勢23中具有重要作用。 (3)LDOC1基因可能在膽道閉鎖發(fā)病過程中起著核心調(diào)控作用。 目的：研究第一部分實驗中發(fā)現(xiàn)的膽道閉鎖中關(guān)鍵基因的表達及突變情況,以驗證基因芯片結(jié)果并進一步揭示該病的發(fā)病機制。 材料與方法： (1)22例膽道閉鎖患兒和14例膽總管囊腫患兒手術(shù)活檢肝臟標(biāo)本,利用RT-PCR方法對趨勢21和趨勢23所發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSG19和LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11進行了半定量檢測。同時以Real-time PCR的方法對LDOC1基因進行了定量檢測。 (2)抽取10例膽道閉鎖患兒外周靜脈血2ML,抽提基因組DNA,對目的基因ITGB2和LDOC1基因外顯子進行擴增純化并測序,了解其突變及SNP改變情況。 結(jié)果： (1)膽道閉鎖肝臟組織中ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSG19、LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11及LDOC1均較膽總管囊腫明顯升高(P0.05)。 (2)對ITGB2基因16個外顯子進行PCR擴增、純化、測序,測序結(jié)果與NCBI參考序列進行比對,發(fā)現(xiàn)：9例患兒(9/10)存在ITGB2基因單核苷酸多態(tài)性改變。這些改變包括3個突變和11個SNP改變。其中突變分別是N212Y(2/10),Y544H(1/10),P752S(4/10)；SNP改變包括：-156T/C(5/10),117G/A(1/10),919G/A(5/10),1101C/A(4/10),1533C/T(1/10),3’-UTR+123C/T(4/10),3’-UTR+140G/A(4/10),3’-UTR+148C/A(6/10),3’-UTR+170C/T(8/10),3’-UTR+219T/C(1/10),3’-UTR+286C/T(3/10)。LDOC1基因僅有1個外顯子,與參考序列相比,在3例患兒(3/10)存在單核苷酸多態(tài)性改變。共有1處SNP改變,為3’UTR+822C/T。 結(jié)論 (1)膽道閉鎖中,ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RGS19、LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11、LDOC1等關(guān)鍵基因表達升高,這些基因的功能主要涉及免疫炎癥及細胞外基質(zhì)重建,說明它們可能參與膽道閉鎖炎癥及纖維化的進程。 (2)膽道閉鎖中ITGB2基因外顯子區(qū)存在多處突變及單核苷酸改變。LDOC1基因外顯子區(qū)存在1處SNP改變。這些突變可能導(dǎo)致相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)及功能改變,從而參與膽道閉鎖的發(fā)病。而SNP改變的存在,可能與膽道閉鎖的疾病易感性相關(guān)。 目的：體外研究LDOC1基因高表達對T淋巴細胞Thl類炎癥因子表達的影響。 方法：體外構(gòu)建pIRES2-EGFP-LDOC1質(zhì)粒,將pIRES2-EGFP-LDOC1和空白質(zhì)粒pIRES2-EGFP重組并包裝腺病毒,感染Jurkat細胞,利用westernblot的方法研究LDOC1蛋白的表達,利用Elisa的方法研究無轉(zhuǎn)染組、pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組和PAd-IRES2-EGFP組細胞在靜息狀態(tài)和PMA激活狀態(tài)下Thl類炎癥因子TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達情況。 結(jié)果：成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-LDOC1質(zhì)粒,并利用腺病毒包裝后轉(zhuǎn)染Jurkat細胞。轉(zhuǎn)染LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉(zhuǎn)染組(PAd-IRES2-EGFP組),LDOC1蛋白表達明顯升高。轉(zhuǎn)染LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉(zhuǎn)染組(PAd-IRES2-EGFP組),在靜息狀態(tài)下在炎癥因子產(chǎn)生上并無明顯差異,但在經(jīng)PMA刺激后,LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉(zhuǎn)染組(PAd-IRES2-EGFP組)TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達均明顯升高,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗具有顯著性差異(p值分別為0.0099、0.0043和0.0026)。 結(jié)論：在Jurkat細胞中高表達LDOC1可以促進炎癥因子TNF-α、IL-2、IFN-γ表達升高。而膽道閉鎖中存在LDOC1基因表達升高,提示其可能對Thl類細胞因子表達具有促進作用,從而加劇膽道閉鎖中持續(xù)而炎癥的免疫損傷。
【圖文】：

總RNA電泳圖

利用GBMS生物信息分析平臺對獲得的1000余條差異基因數(shù)據(jù)進行分析，得到如下結(jié)果:1.顯著性基因表達趨勢及功能分析(圖4)Pro栩es“ deredbasedonthe卜vakleslgn欣aneeof側(cè)月油erotg即esass沖隴dversusexPected圈.1圈.惻園團口目涵目目日口曰因圈園口翹曰圖日圈曰圖4基因表達趨勢(注:每種趨勢的左上角的數(shù)字為趨勢編號;左下角值為P值，，如profilezl的顯著性水平P值為1、10一，‘，其中著色部分為顯著性表達趨勢，而綠色部分為最具顯著性表達趨勢，后續(xù)實驗選擇最具顯著性的表達趨勢21和23進行深入分析)經(jīng)過趨勢分析，我們發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖和膽總管囊腫間存在顯著差異，而膽道閉鎖的三張芯片內(nèi)部并無明顯差異。其中綠色部分的趨勢21和趨勢23的基因表達趨勢具有最顯著性差異，根據(jù)基因功能分布發(fā)現(xiàn)，趨勢21主要涉及組織相容性抗原復(fù)合物n介導(dǎo)的外源性抗原呈遞作用以及由此導(dǎo)致的免疫反應(yīng)，該作用主要涉及的細胞內(nèi)定位為溶酶體。趨勢23主要涉及器官組織發(fā)育、細胞外基質(zhì)形成，陰離子轉(zhuǎn)運與磷酸基團轉(zhuǎn)運。這些功能導(dǎo)致了膽道閉鎖與膽總管囊腫的主要差異。2.顯著性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R726.5

【參考文獻】

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本文編號：2612239