【摘要】：研究背景楓糖尿癥(maple syrup urine disease,MSUD)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病,死亡率和致殘率高,臨床危害性大。MSUD總體發(fā)病率為1:185000,我國關(guān)于楓糖尿癥的研究甚少,缺乏大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),發(fā)病率不明。MSUD是由于細(xì)胞線粒體基質(zhì)內(nèi)支鏈a酮酸脫氫酶多酶復(fù)合體(BCKDC)功能缺陷導(dǎo)致的支鏈氨基酸代謝病。BCKDC包括E1(分為E1a及E1β兩個亞基)、E2、E3、BCKD激酶和BCKD磷酸酶,任何一個亞單位發(fā)生變化,均會影響其分解代謝的功能;而調(diào)控BCKDC復(fù)合體的酶功能異常如PPMIK(mitochondrial protein phosphatase線粒體蛋白磷酸酶)也會引MSUD。以上成分缺陷均可導(dǎo)致高濃度的支鏈氨基酸及其酮酸衍生物在機(jī)體血液、尿液、腦脊液中蓄積,阻礙腦組織的能量代謝,從而出現(xiàn)一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。目前已明確的MSUD 致病基因有BCKDHB、DLD、DBT和PPMIK。MSUD根據(jù)其發(fā)病時間、病情進(jìn)展速度及對維生素B1的反應(yīng)性,可分為經(jīng)典型、間歇型、中間型、維生素B1有效型和E3亞單位缺陷型。其中經(jīng)典型是新生兒時期最常見的類型,病情嚴(yán)重,主要臨床表現(xiàn)為反應(yīng)差、頻繁驚厥、低血糖等,常于數(shù)日內(nèi)死亡。由于其臨床表現(xiàn)缺乏特異性,易造成誤診而延遲治療,導(dǎo)致該病死亡率居高不下或引起高致殘率。故早診斷、早干預(yù)和早治療,提高患兒的存活率,改善生存質(zhì)量是目前臨床迫切需要解決的課題。長期以來,MSUD基因功能與發(fā)病機(jī)制的研究受限于研究模型的建立,誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是由體細(xì)胞經(jīng)重編程而獲得的具有胚胎干細(xì)胞特性和功能的多能干細(xì)胞,患兒來源的iPSC作為遺傳性疾病的研究模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。因其無倫理問題,具有多項(xiàng)分化潛能,經(jīng)誘導(dǎo)可分化為各種類型的體細(xì)胞,且攜帶疾病特異性的缺陷基因,為研究罕見遺傳性疾病的發(fā)病機(jī)制提供了革命性的技術(shù)手段。本課題在前期遺傳代謝病篩查工作基礎(chǔ)上對7例高度疑診MSUD的患兒進(jìn)行了詳細(xì)的臨床表型、實(shí)驗(yàn)室檢查以及遺傳學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)7例患兒中5例為BCKDHB基因突變,2例為BCKDHA基因突變,其中7個突變?yōu)槲丛鴪蟮赖男峦蛔�。為進(jìn)一步明確新突變的致病性,我們采集了一例存活患兒的外周血誘導(dǎo)為iPSC細(xì)胞并進(jìn)行了鑒定,又對基因突變位點(diǎn)和蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測驗(yàn)證,構(gòu)建起MSUD患兒的iPSC細(xì)胞體外研究模型,為進(jìn)一步深入研究MSUD的發(fā)病機(jī)制,探索基因功能,進(jìn)行藥物篩選和可能的基因治療奠定了基礎(chǔ)。第一部分 楓糖尿癥患兒臨床特征、基因突變分析目的分析7例MSUD患兒的臨床特征及其基因突變類型,總結(jié)其發(fā)病特點(diǎn)探索疾病表型與基因型的關(guān)系,以期早期診斷、早期干預(yù)和早期治療,盡可能挽救患兒生命,提高新生兒的存活率,改善患兒生活質(zhì)量。方法通過血液、尿液質(zhì)譜篩查出7例高度疑似MSUD的患兒,進(jìn)行臨床表型分析、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查及基因檢測和生物信息學(xué)分析,具體方法如下:1.臨床資料與檢查:采集現(xiàn)病史、喂養(yǎng)史、個人史、家族史等資料,進(jìn)行體格檢查。2.實(shí)驗(yàn)室檢查:血常規(guī)、生化檢查、血?dú)夥治觥⒛X脊液常規(guī)、血液氨基酸、尿液有機(jī)酸檢查等。3.影像學(xué)檢查:頭顱核磁共振或超聲檢查。4.腦電圖檢查:振幅整合腦電圖監(jiān)測。5.分子遺傳學(xué)檢查5.1采用目標(biāo)區(qū)域捕獲結(jié)合新一代測序技術(shù),對7例患兒進(jìn)行高通量測序,重點(diǎn)分析與MSUD相關(guān)基因(BCKDHA,BCKDHB,DBT,DLD,PPMIK)的外顯子與相鄰的內(nèi)含子區(qū)域(50bp)。5.2生物信息學(xué)分析:測序數(shù)據(jù)應(yīng)用NextGene V2.3.4軟件與UCSC hg19人類參考基因組序列進(jìn)行比對,并對目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的覆蓋度和測序質(zhì)量進(jìn)行評估;依據(jù)嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)對變異進(jìn)行過濾,然后通過HGMD、ClinVar、OMIM數(shù)據(jù)庫查找突變信息;UCSC、Ensembl數(shù)據(jù)庫和Clustx進(jìn)行蛋白質(zhì)保守性預(yù)測;Mutation taster、PolyPhen2等生物信息學(xué)軟件預(yù)測變異的致病性;Swiss-PDB Viewer軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測等;對檢測到的潛在致病性變異進(jìn)行患兒及其父母的驗(yàn)證:點(diǎn)突變和小的插入缺失突變采用Sanger測序驗(yàn)證,對于大片段缺失及重復(fù)突變采用實(shí)時定量PCR驗(yàn)證。6.患兒臨床表型與基因型關(guān)系分析:根據(jù)7例患兒的臨床表現(xiàn)及病情進(jìn)展情況對楓糖尿癥進(jìn)行臨床分型,并與其基因型進(jìn)行比較和分析。結(jié)果1.臨床檢查:7例患兒中男5例,女2例,發(fā)病日齡均小于10天,主要臨床表現(xiàn)為易激惹,反應(yīng)差,喂養(yǎng)困難,肌張力異常,驚厥等。診斷的時間從4-5小時至生后22天不等,(其中第7例入院后4-5小時被高度疑診為MSUD)。7例病人中,病例1和病例2表現(xiàn)為肌張力增高,余表現(xiàn)為肌張力降低;病例1,4,5,6,7出現(xiàn)驚厥;病例1,3,4伴有不同程度發(fā)熱;病例3,4,5,7表現(xiàn)為酸堿失衡包括呼吸性酸中毒、呼吸性堿中毒和代謝性酸中毒;病例6需要機(jī)械通氣,病情進(jìn)展迅速;病例1,3,4,5,6患兒分別于生后17天,33天,10天,18天,22天死亡;病例2存活時間較長,但明顯發(fā)育遲緩;病例7仍需臨床觀察。2.實(shí)驗(yàn)室檢查:2.1血常規(guī)檢查:病例2在40天日齡時發(fā)現(xiàn)合并嚴(yán)重貧血,經(jīng)過楓糖尿癥的綜合治療,血紅蛋白在患兒3歲3個月時上升至正常水平120g/L;病例5存在輕度貧血,其余患兒無貧血情況。2.2生化指標(biāo)檢測:血糖監(jiān)測病例2偏低為2.8mmol/L;血氨檢測病例2,3,4,5輕度升高,病例7進(jìn)行性升高;血清谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶結(jié)果除病例3正常外,其余患兒均明顯升高在95.14-178U/L;除病例3血清淀粉酶正常外,其余均降低;血清心肌酶檢測顯示血清乳酸脫氫酶和羥丁酸脫氫酶均存在不同程度升高,除病例1血清肌酸激酶正常,其余患兒均升高在224-330 U/L之間。2.3血?dú)夥治?病例3存在輕度呼吸性酸中毒,病例4存在輕度呼吸性堿中毒,病例5和7為代謝性酸中毒并呼吸性堿中毒,病例1和6的血?dú)夥治鼋Y(jié)果均在正常范圍,病例2未做血?dú)夥治鰴z查。2.4腦脊液檢查:出現(xiàn)驚厥的患兒1,4,5,6,7腦脊液氯化物、糖在正常范圍,腦脊液蛋白均高于正常,但細(xì)胞數(shù)均低于10×106/L,細(xì)菌檢測陰性。2.5血液氨基酸檢測:除病例2的纈氨酸水平在正常范圍外,其余患兒纈氨酸水平在300.01-744.48umol/L之間;亮氨酸加異亮氨酸在605.91-3249.18umol/L;亮氨酸加異亮氨酸/苯丙氨酸在16.91-100.19umol/L。2.6尿液有機(jī)酸檢測:大多患兒顯示支鏈α酮酸明顯升高,如2-羥-異戊酸水平在181.2-446.76之間;2-酮-異戊酸水平在101.92-207.97之間;2-酮-3-甲基戊酸水平在58.1-442.98之間;2-酮-異已酸水平138.2-679.11之間。3.影像學(xué)檢查結(jié)果:頭顱磁共振顯示:符合代謝性腦病的影像表現(xiàn),兩側(cè)腦橋、中腦、延髓、小腦蚓部、丘腦、放射冠、半卵圓中心、雙側(cè)蒼白球、內(nèi)囊等部位均呈現(xiàn)廣泛異常高信號;病例6,7的頭顱MRI結(jié)果顯示雙側(cè)基底節(jié)區(qū)、腦干、小腦內(nèi)可見對稱性異常信號影,證實(shí)為代謝性腦病的影像學(xué)改變;病例1床邊頭顱彩超顯示:雙側(cè)室管膜下均探及囊狀液性暗區(qū),雙側(cè)腦實(shí)質(zhì)回聲略增強(qiáng)。4.腦電圖及其他檢查結(jié)果:病例6顯示:異常振幅整合腦電圖,波形連續(xù),電壓波幅在正常范圍,睡眠周期欠佳,可見散在尖波、棘波、快波、監(jiān)測過程中可見一次癇性放電。5.分子遺傳學(xué)檢查結(jié)果:7例患兒中1,2,3,4,6例具有BCKDHB基因突變,包括4例復(fù)合雜合突變,1例純合突變;2例(病例5和7)為BCKDHA基因復(fù)合雜合突變。其中7個為未曾報道的新突變,包括c.863GA及外顯子5-9大片段缺失屬于 基因突變,c.523TC、c.659delA、c.550delT、c.665AC及外顯子1-7大片段缺失屬于BCKDHB基因突變。6.臨床表型與基因型關(guān)系分析:患兒均為BCKDHB和BCKDHA基因突變導(dǎo)致,但其臨床表型與基因型無對應(yīng)關(guān)系,其中病例1,3,4,5,6為經(jīng)典型MSUD,預(yù)后差,死于出生后17天-33天;病例2屬于中間型;病例7的起病特點(diǎn)與經(jīng)典型一致,但是臨床進(jìn)展過程類似維生素B1有效型,仍需臨床觀察。結(jié)論BCKDHB與BCKDHA基因可能是本地MSUD的主要致病基因;BCKDHB基因的一個新突變c.659delA可能是本地MSUD患兒的突變熱點(diǎn);血液氨基酸與尿液有機(jī)酸篩查有助于快速篩查MSUD,便于臨床及時采取治療措施;新一代測序技術(shù)可以精準(zhǔn)診斷MSUD并且發(fā)現(xiàn)新的突變基因。第二部分MSUD患兒來源iPSC細(xì)胞系的建立目的建立MSUD患兒來源的iPSC細(xì)胞系,為進(jìn)一步深入研究MSUD的發(fā)病機(jī)制,探索基因功能以及藥物篩選和基因治療奠定基礎(chǔ)。方法1.iPSC細(xì)胞的誘導(dǎo):以第7例MSUD患兒為例,采集MSUD患兒外周血分離有核細(xì)胞,采用非整合重編程技術(shù)應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀對細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)染,直至出現(xiàn)明顯的干細(xì)胞形態(tài),挑取克隆繼續(xù)培養(yǎng)。2.iPSC細(xì)胞系的鑒定:培養(yǎng)至第十代時,采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對iPSC細(xì)胞進(jìn)行多能性分子標(biāo)記物鑒定;利用qRT-PCR檢測內(nèi)源性多能基因OCT4、SOX2、NANOG的表達(dá);采用擬胚體自分化驗(yàn)證iPSC細(xì)胞多向分化潛能,qRT-PCR來分別檢測三個胚層的分子標(biāo)記物表達(dá)情況;對多能干細(xì)胞進(jìn)行PCR驗(yàn)證外源基因表達(dá);對iPSC進(jìn)行染色體核型分析,鑒定核型是否正常。3.基因突變的驗(yàn)證:采用Sanger測序技術(shù),在3130XL DNAAnalyzer分析儀上測序驗(yàn)證基因的突變位點(diǎn);應(yīng)用Western blot蛋白印跡對缺陷蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行分析,并與正常對照相比,最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.iPSC細(xì)胞的誘導(dǎo):采用非整合重編程技術(shù)誘導(dǎo)的患兒來源的外周血細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的胚胎干細(xì)胞形態(tài)。2.iPSC細(xì)胞系鑒定:免疫熒光結(jié)果顯示iPSC可以檢測到多種多能性標(biāo)志物的表達(dá),如 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA4 以及 OCT3/4 和 NANOG;qRT-PCR 檢測顯示三種內(nèi)源性多能基因OCT4、SOX2、NANOG都有表達(dá);iPSC分化形成典型的胚狀體結(jié)構(gòu),并可以檢測到內(nèi)、中、外胚層的特異性標(biāo)志物SOX17、GATA4、RUNX1、HAND1、PAX6以及NR2F2的表達(dá),表明患兒來源的iPSC具有分化成三個胚層的潛能;對誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能干細(xì)胞的染色體核型進(jìn)行鑒定,顯示為正常核型且無異常染色體發(fā)現(xiàn);PCR結(jié)果顯示iPSC無外源基因表達(dá)。3.基因突變驗(yàn)證:Sanger測序驗(yàn)證顯示患兒來源的iPSC在BCKDHA基因上存在與患兒相同的c.632CT及c.1280-1282delTGG復(fù)合雜合突變。Western blot蛋白質(zhì)表達(dá)分析結(jié)果顯示,患兒來源的iPSC細(xì)胞中BCKDH-E1α表達(dá)量與對照組(日齡、性別相匹配的非遺傳性疾病新生兒)相比明顯降低(P0.01)。結(jié)論采用非整合重編程技術(shù)建立起MSUD患兒外周血來源的iPSC細(xì)胞系;該iPSC細(xì)胞系攜帶有與患兒相同的c.632CT及c.1280-1282delTGG復(fù)合雜合突變;該細(xì)胞系的建立為進(jìn)一步研究MSUD的發(fā)病機(jī)制、基因功能及藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

生物信息分析軟件Ｍｕｔａｔｉｏｎ＿Ｔａｓｔｅｒ預(yù)測有害（見圖２．２），按照ＡＣＭＧ標(biāo)逡逑準(zhǔn)，ｃ．６５９ｄｅｌＡ邋突變定義為致病性突變（ＰＶＳｌ＋ＰＭ２＋ＰＰｌ＋ＰＰ３＋ＰＰ４）0ＰＶＳｌ：邋（ｖｅｒｙ逡逑ｓｔｒｏｎｇ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）極強(qiáng)的致病證據(jù)，又稱為烈性突變，為功能缺失型突變，逡逑本患兒的框移突變屬于此類范疇；ＰＭ２邋（ｍｏｄｅｒａｔｅ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）為較強(qiáng)的致病逡逑證據(jù)，在邋ＥＳＰ邋（Ｅｘｏｍｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋Ｐｒｏｊｅｃｔ），，１０００邋Ｇｅｎｏｍｅｓ邋Ｐｒｏｊｅｃｔ邋和邋ＥＡＣ邋（Ｅｘｏｍｅ逡逑Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ邋Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）中的等位基因頻率是０，允許低頻的隱性遺傳突變頻率。逡逑ＰＰ邋（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）為支持的致病證據(jù)。疾�。硇蜑椋欤庑�。逡逑Ａ邐□邐＇邐：逡逑ｘ＾ｕ邐１ＪＵ逡逑ＴＡＴＣ邋ＧＣＴＡＴｉＧＣＴＣＴＧＧＧ逡逑？邋Ｃ．５０８Ｃ＾Ｔ逡逑／ＷＶ＼ＡＡＡ／Ｖ＼ｉＡＡＡ邋八邋Ｍ邋八八逡逑６０邐７０邐８０逡逑■邋佭邋■■■■■■■邐ｗｍ邐ｈ邐■逡逑；Ｃ邋Ｃ邋Ｃ邋Ｔ邋Ｔ邋ＴＣＣｉ邐Ｇ邋Ｇ邋Ｃ邋Ｃ邋Ａ邋Ａ邋Ａ邋Ｇ邋Ａ邋Ａ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｃ逡逑■邋ｃ．６５９ｄｅｌＡ逡逑圖２．丨．Ｓａｎｇｅｒ測序驗(yàn)證結(jié)果顯示，患兒尺Ｄ／／５基因第五和第六外顯于分別具有兩個逡逑突變：ｃ．５０８Ｃ＞Ｔ邋（ｐ．Ｒ１７０Ｃ）和ｃ．６５９ｄｅｌＡ邋（Ｑ２２０Ｒｆｓ＊１０）

ＰＰ邋（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）為支持的致病證據(jù)。疾�。硇蜑椋欤庑�。逡逑Ａ邐□邐＇邐：逡逑ｘ＾ｕ邐１ＪＵ逡逑ＴＡＴＣ邋ＧＣＴＡＴｉＧＣＴＣＴＧＧＧ逡逑？邋Ｃ．５０８Ｃ＾Ｔ逡逑／ＷＶ＼ＡＡＡ／Ｖ＼ｉＡＡＡ邋八邋Ｍ邋八八逡逑６０邐７０邐８０逡逑■邋佭邋■■■■■■■邐ｗｍ邐ｈ邐■逡逑；Ｃ邋Ｃ邋Ｃ邋Ｔ邋Ｔ邋ＴＣＣｉ邐Ｇ邋Ｇ邋Ｃ邋Ｃ邋Ａ邋Ａ邋Ａ邋Ｇ邋Ａ邋Ａ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｃ逡逑■邋ｃ．６５９ｄｅｌＡ逡逑圖２．丨．Ｓａｎｇｅｒ測序驗(yàn)證結(jié)果顯示，患兒尺Ｄ／／５基因第五和第六外顯于分別具有兩個逡逑突變：ｃ．５０８Ｃ＞Ｔ邋（ｐ．Ｒ１７０Ｃ）和ｃ．６５９ｄｅｌＡ邋（Ｑ２２０Ｒｆｓ＊１０），分別來自父親和母親，為復(fù)合逡逑雜合突變。逡逑ｍｕｔａｔｉｏｎ邋ｔ＠ｓｔｉｎｇ逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R725.8

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本文編號：2611619