【摘要】：研究背景楓糖尿癥(maple syrup urine disease,MSUD)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病,死亡率和致殘率高,臨床危害性大。MSUD總體發(fā)病率為1:185000,我國關于楓糖尿癥的研究甚少,缺乏大數(shù)據(jù)統(tǒng)計,發(fā)病率不明。MSUD是由于細胞線粒體基質內支鏈a酮酸脫氫酶多酶復合體(BCKDC)功能缺陷導致的支鏈氨基酸代謝病。BCKDC包括E1(分為E1a及E1β兩個亞基)、E2、E3、BCKD激酶和BCKD磷酸酶,任何一個亞單位發(fā)生變化,均會影響其分解代謝的功能;而調控BCKDC復合體的酶功能異常如PPMIK(mitochondrial protein phosphatase線粒體蛋白磷酸酶)也會引MSUD。以上成分缺陷均可導致高濃度的支鏈氨基酸及其酮酸衍生物在機體血液、尿液、腦脊液中蓄積,阻礙腦組織的能量代謝,從而出現(xiàn)一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。目前已明確的MSUD 致病基因有BCKDHB、DLD、DBT和PPMIK。MSUD根據(jù)其發(fā)病時間、病情進展速度及對維生素B1的反應性,可分為經(jīng)典型、間歇型、中間型、維生素B1有效型和E3亞單位缺陷型。其中經(jīng)典型是新生兒時期最常見的類型,病情嚴重,主要臨床表現(xiàn)為反應差、頻繁驚厥、低血糖等,常于數(shù)日內死亡。由于其臨床表現(xiàn)缺乏特異性,易造成誤診而延遲治療,導致該病死亡率居高不下或引起高致殘率。故早診斷、早干預和早治療,提高患兒的存活率,改善生存質量是目前臨床迫切需要解決的課題。長期以來,MSUD基因功能與發(fā)病機制的研究受限于研究模型的建立,誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是由體細胞經(jīng)重編程而獲得的具有胚胎干細胞特性和功能的多能干細胞,患兒來源的iPSC作為遺傳性疾病的研究模型已經(jīng)廣泛應用于基礎研究。因其無倫理問題,具有多項分化潛能,經(jīng)誘導可分化為各種類型的體細胞,且攜帶疾病特異性的缺陷基因,為研究罕見遺傳性疾病的發(fā)病機制提供了革命性的技術手段。本課題在前期遺傳代謝病篩查工作基礎上對7例高度疑診MSUD的患兒進行了詳細的臨床表型、實驗室檢查以及遺傳學分析,發(fā)現(xiàn)7例患兒中5例為BCKDHB基因突變,2例為BCKDHA基因突變,其中7個突變?yōu)槲丛鴪蟮赖男峦蛔�。為進一步明確新突變的致病性,我們采集了一例存活患兒的外周血誘導為iPSC細胞并進行了鑒定,又對基因突變位點和蛋白表達進行了檢測驗證,構建起MSUD患兒的iPSC細胞體外研究模型,為進一步深入研究MSUD的發(fā)病機制,探索基因功能,進行藥物篩選和可能的基因治療奠定了基礎。第一部分 楓糖尿癥患兒臨床特征、基因突變分析目的分析7例MSUD患兒的臨床特征及其基因突變類型,總結其發(fā)病特點探索疾病表型與基因型的關系,以期早期診斷、早期干預和早期治療,盡可能挽救患兒生命,提高新生兒的存活率,改善患兒生活質量。方法通過血液、尿液質譜篩查出7例高度疑似MSUD的患兒,進行臨床表型分析、常規(guī)實驗室檢查及基因檢測和生物信息學分析,具體方法如下:1.臨床資料與檢查:采集現(xiàn)病史、喂養(yǎng)史、個人史、家族史等資料,進行體格檢查。2.實驗室檢查:血常規(guī)、生化檢查、血氣分析、腦脊液常規(guī)、血液氨基酸、尿液有機酸檢查等。3.影像學檢查:頭顱核磁共振或超聲檢查。4.腦電圖檢查:振幅整合腦電圖監(jiān)測。5.分子遺傳學檢查5.1采用目標區(qū)域捕獲結合新一代測序技術,對7例患兒進行高通量測序,重點分析與MSUD相關基因(BCKDHA,BCKDHB,DBT,DLD,PPMIK)的外顯子與相鄰的內含子區(qū)域(50bp)。5.2生物信息學分析:測序數(shù)據(jù)應用NextGene V2.3.4軟件與UCSC hg19人類參考基因組序列進行比對,并對目標區(qū)域內的覆蓋度和測序質量進行評估;依據(jù)嚴格的篩選標準對變異進行過濾,然后通過HGMD、ClinVar、OMIM數(shù)據(jù)庫查找突變信息;UCSC、Ensembl數(shù)據(jù)庫和Clustx進行蛋白質保守性預測;Mutation taster、PolyPhen2等生物信息學軟件預測變異的致病性;Swiss-PDB Viewer軟件進行蛋白質三級結構預測等;對檢測到的潛在致病性變異進行患兒及其父母的驗證:點突變和小的插入缺失突變采用Sanger測序驗證,對于大片段缺失及重復突變采用實時定量PCR驗證。6.患兒臨床表型與基因型關系分析:根據(jù)7例患兒的臨床表現(xiàn)及病情進展情況對楓糖尿癥進行臨床分型,并與其基因型進行比較和分析。結果1.臨床檢查:7例患兒中男5例,女2例,發(fā)病日齡均小于10天,主要臨床表現(xiàn)為易激惹,反應差,喂養(yǎng)困難,肌張力異常,驚厥等。診斷的時間從4-5小時至生后22天不等,(其中第7例入院后4-5小時被高度疑診為MSUD)。7例病人中,病例1和病例2表現(xiàn)為肌張力增高,余表現(xiàn)為肌張力降低;病例1,4,5,6,7出現(xiàn)驚厥;病例1,3,4伴有不同程度發(fā)熱;病例3,4,5,7表現(xiàn)為酸堿失衡包括呼吸性酸中毒、呼吸性堿中毒和代謝性酸中毒;病例6需要機械通氣,病情進展迅速;病例1,3,4,5,6患兒分別于生后17天,33天,10天,18天,22天死亡;病例2存活時間較長,但明顯發(fā)育遲緩;病例7仍需臨床觀察。2.實驗室檢查:2.1血常規(guī)檢查:病例2在40天日齡時發(fā)現(xiàn)合并嚴重貧血,經(jīng)過楓糖尿癥的綜合治療,血紅蛋白在患兒3歲3個月時上升至正常水平120g/L;病例5存在輕度貧血,其余患兒無貧血情況。2.2生化指標檢測:血糖監(jiān)測病例2偏低為2.8mmol/L;血氨檢測病例2,3,4,5輕度升高,病例7進行性升高;血清谷氨酰胺轉肽酶結果除病例3正常外,其余患兒均明顯升高在95.14-178U/L;除病例3血清淀粉酶正常外,其余均降低;血清心肌酶檢測顯示血清乳酸脫氫酶和羥丁酸脫氫酶均存在不同程度升高,除病例1血清肌酸激酶正常,其余患兒均升高在224-330 U/L之間。2.3血氣分析:病例3存在輕度呼吸性酸中毒,病例4存在輕度呼吸性堿中毒,病例5和7為代謝性酸中毒并呼吸性堿中毒,病例1和6的血氣分析結果均在正常范圍,病例2未做血氣分析檢查。2.4腦脊液檢查:出現(xiàn)驚厥的患兒1,4,5,6,7腦脊液氯化物、糖在正常范圍,腦脊液蛋白均高于正常,但細胞數(shù)均低于10×106/L,細菌檢測陰性。2.5血液氨基酸檢測:除病例2的纈氨酸水平在正常范圍外,其余患兒纈氨酸水平在300.01-744.48umol/L之間;亮氨酸加異亮氨酸在605.91-3249.18umol/L;亮氨酸加異亮氨酸/苯丙氨酸在16.91-100.19umol/L。2.6尿液有機酸檢測:大多患兒顯示支鏈α酮酸明顯升高,如2-羥-異戊酸水平在181.2-446.76之間;2-酮-異戊酸水平在101.92-207.97之間;2-酮-3-甲基戊酸水平在58.1-442.98之間;2-酮-異已酸水平138.2-679.11之間。3.影像學檢查結果:頭顱磁共振顯示:符合代謝性腦病的影像表現(xiàn),兩側腦橋、中腦、延髓、小腦蚓部、丘腦、放射冠、半卵圓中心、雙側蒼白球、內囊等部位均呈現(xiàn)廣泛異常高信號;病例6,7的頭顱MRI結果顯示雙側基底節(jié)區(qū)、腦干、小腦內可見對稱性異常信號影,證實為代謝性腦病的影像學改變;病例1床邊頭顱彩超顯示:雙側室管膜下均探及囊狀液性暗區(qū),雙側腦實質回聲略增強。4.腦電圖及其他檢查結果:病例6顯示:異常振幅整合腦電圖,波形連續(xù),電壓波幅在正常范圍,睡眠周期欠佳,可見散在尖波、棘波、快波、監(jiān)測過程中可見一次癇性放電。5.分子遺傳學檢查結果:7例患兒中1,2,3,4,6例具有BCKDHB基因突變,包括4例復合雜合突變,1例純合突變;2例(病例5和7)為BCKDHA基因復合雜合突變。其中7個為未曾報道的新突變,包括c.863GA及外顯子5-9大片段缺失屬于 基因突變,c.523TC、c.659delA、c.550delT、c.665AC及外顯子1-7大片段缺失屬于BCKDHB基因突變。6.臨床表型與基因型關系分析:患兒均為BCKDHB和BCKDHA基因突變導致,但其臨床表型與基因型無對應關系,其中病例1,3,4,5,6為經(jīng)典型MSUD,預后差,死于出生后17天-33天;病例2屬于中間型;病例7的起病特點與經(jīng)典型一致,但是臨床進展過程類似維生素B1有效型,仍需臨床觀察。結論BCKDHB與BCKDHA基因可能是本地MSUD的主要致病基因;BCKDHB基因的一個新突變c.659delA可能是本地MSUD患兒的突變熱點;血液氨基酸與尿液有機酸篩查有助于快速篩查MSUD,便于臨床及時采取治療措施;新一代測序技術可以精準診斷MSUD并且發(fā)現(xiàn)新的突變基因。第二部分MSUD患兒來源iPSC細胞系的建立目的建立MSUD患兒來源的iPSC細胞系,為進一步深入研究MSUD的發(fā)病機制,探索基因功能以及藥物篩選和基因治療奠定基礎。方法1.iPSC細胞的誘導:以第7例MSUD患兒為例,采集MSUD患兒外周血分離有核細胞,采用非整合重編程技術應用電轉儀對細胞進行核轉染,直至出現(xiàn)明顯的干細胞形態(tài),挑取克隆繼續(xù)培養(yǎng)。2.iPSC細胞系的鑒定:培養(yǎng)至第十代時,采用細胞免疫熒光技術對iPSC細胞進行多能性分子標記物鑒定;利用qRT-PCR檢測內源性多能基因OCT4、SOX2、NANOG的表達;采用擬胚體自分化驗證iPSC細胞多向分化潛能,qRT-PCR來分別檢測三個胚層的分子標記物表達情況;對多能干細胞進行PCR驗證外源基因表達;對iPSC進行染色體核型分析,鑒定核型是否正常。3.基因突變的驗證:采用Sanger測序技術,在3130XL DNAAnalyzer分析儀上測序驗證基因的突變位點;應用Western blot蛋白印跡對缺陷蛋白質的表達進行分析,并與正常對照相比,最后進行統(tǒng)計分析。結果1.iPSC細胞的誘導:采用非整合重編程技術誘導的患兒來源的外周血細胞呈現(xiàn)顯著的胚胎干細胞形態(tài)。2.iPSC細胞系鑒定:免疫熒光結果顯示iPSC可以檢測到多種多能性標志物的表達,如 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA4 以及 OCT3/4 和 NANOG;qRT-PCR 檢測顯示三種內源性多能基因OCT4、SOX2、NANOG都有表達;iPSC分化形成典型的胚狀體結構,并可以檢測到內、中、外胚層的特異性標志物SOX17、GATA4、RUNX1、HAND1、PAX6以及NR2F2的表達,表明患兒來源的iPSC具有分化成三個胚層的潛能;對誘導產(chǎn)生的多能干細胞的染色體核型進行鑒定,顯示為正常核型且無異常染色體發(fā)現(xiàn);PCR結果顯示iPSC無外源基因表達。3.基因突變驗證:Sanger測序驗證顯示患兒來源的iPSC在BCKDHA基因上存在與患兒相同的c.632CT及c.1280-1282delTGG復合雜合突變。Western blot蛋白質表達分析結果顯示,患兒來源的iPSC細胞中BCKDH-E1α表達量與對照組(日齡、性別相匹配的非遺傳性疾病新生兒)相比明顯降低(P0.01)。結論采用非整合重編程技術建立起MSUD患兒外周血來源的iPSC細胞系;該iPSC細胞系攜帶有與患兒相同的c.632CT及c.1280-1282delTGG復合雜合突變;該細胞系的建立為進一步研究MSUD的發(fā)病機制、基因功能及藥物篩選奠定了基礎。
【圖文】：

生物信息分析軟件Ｍｕｔａｔｉｏｎ＿Ｔａｓｔｅｒ預測有害（見圖２．２），按照ＡＣＭＧ標逡逑準，ｃ．６５９ｄｅｌＡ邋突變定義為致病性突變（ＰＶＳｌ＋ＰＭ２＋ＰＰｌ＋ＰＰ３＋ＰＰ４）0ＰＶＳｌ：邋（ｖｅｒｙ逡逑ｓｔｒｏｎｇ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）極強的致病證據(jù)，又稱為烈性突變，為功能缺失型突變，逡逑本患兒的框移突變屬于此類范疇；ＰＭ２邋（ｍｏｄｅｒａｔｅ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）為較強的致病逡逑證據(jù)，在邋ＥＳＰ邋（Ｅｘｏｍｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋Ｐｒｏｊｅｃｔ），，１０００邋Ｇｅｎｏｍｅｓ邋Ｐｒｏｊｅｃｔ邋和邋ＥＡＣ邋（Ｅｘｏｍｅ逡逑Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ邋Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）中的等位基因頻率是０，允許低頻的隱性遺傳突變頻率。逡逑ＰＰ邋（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）為支持的致病證據(jù)。疾�。硇蜑椋欤庑�。逡逑Ａ邐□邐＇邐：逡逑ｘ＾ｕ邐１ＪＵ逡逑ＴＡＴＣ邋ＧＣＴＡＴｉＧＣＴＣＴＧＧＧ逡逑？邋Ｃ．５０８Ｃ＾Ｔ逡逑／ＷＶ＼ＡＡＡ／Ｖ＼ｉＡＡＡ邋八邋Ｍ邋八八逡逑６０邐７０邐８０逡逑■邋佭邋■■■■■■■邐ｗｍ邐ｈ邐■逡逑；Ｃ邋Ｃ邋Ｃ邋Ｔ邋Ｔ邋ＴＣＣｉ邐Ｇ邋Ｇ邋Ｃ邋Ｃ邋Ａ邋Ａ邋Ａ邋Ｇ邋Ａ邋Ａ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｃ逡逑■邋ｃ．６５９ｄｅｌＡ逡逑圖２．丨．Ｓａｎｇｅｒ測序驗證結果顯示，患兒尺Ｄ／／５基因第五和第六外顯于分別具有兩個逡逑突變：ｃ．５０８Ｃ＞Ｔ邋（ｐ．Ｒ１７０Ｃ）和ｃ．６５９ｄｅｌＡ邋（Ｑ２２０Ｒｆｓ＊１０）

ＰＰ邋（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）為支持的致病證據(jù)。疾病／表型為ｌｂ型。逡逑Ａ邐□邐＇邐：逡逑ｘ＾ｕ邐１ＪＵ逡逑ＴＡＴＣ邋ＧＣＴＡＴｉＧＣＴＣＴＧＧＧ逡逑？邋Ｃ．５０８Ｃ＾Ｔ逡逑／ＷＶ＼ＡＡＡ／Ｖ＼ｉＡＡＡ邋八邋Ｍ邋八八逡逑６０邐７０邐８０逡逑■邋佭邋■■■■■■■邐ｗｍ邐ｈ邐■逡逑；Ｃ邋Ｃ邋Ｃ邋Ｔ邋Ｔ邋ＴＣＣｉ邐Ｇ邋Ｇ邋Ｃ邋Ｃ邋Ａ邋Ａ邋Ａ邋Ｇ邋Ａ邋Ａ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｃ逡逑■邋ｃ．６５９ｄｅｌＡ逡逑圖２．丨．Ｓａｎｇｅｒ測序驗證結果顯示，患兒尺Ｄ／／５基因第五和第六外顯于分別具有兩個逡逑突變：ｃ．５０８Ｃ＞Ｔ邋（ｐ．Ｒ１７０Ｃ）和ｃ．６５９ｄｅｌＡ邋（Ｑ２２０Ｒｆｓ＊１０），分別來自父親和母親，為復合逡逑雜合突變。逡逑ｍｕｔａｔｉｏｎ邋ｔ＠ｓｔｉｎｇ逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R725.8

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本文編號：2611619