【摘要】： 前言 隨著通氣策略的改變、產(chǎn)前糖皮質(zhì)激素及生后肺表面活性物質(zhì)的應(yīng)用,越來越多的早產(chǎn)兒和極低出生體重兒得以存活,但支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasis,BPD)仍然存在,BPD是一種慢性肺疾病(Chroniclung disease,CLD),通常發(fā)生在患透明膜病、接受氧療、機(jī)械通氣治療的早產(chǎn)兒。目前多數(shù)人主張采用BPD命名,認(rèn)為此命名可清楚的區(qū)分多種原因?qū)е碌腃LD。早產(chǎn)兒BPD定義為生后28天或糾正胎齡(胎齡+日齡)36周仍需吸氧者,此定義更能準(zhǔn)確地預(yù)測肺的預(yù)后。BPD臨床表現(xiàn)主要為患兒依賴吸氧,在原發(fā)病基本改善后仍需要機(jī)械通氣和吸氧,反復(fù)發(fā)生不易控制的肺部感染,呼吸困難明顯,易發(fā)生CO_2蓄積和低氧血癥,肺功能指標(biāo)明顯下降,部分患兒并發(fā)肺動脈高壓和心力衰竭。重者多于生后一年內(nèi)死于呼吸衰竭。存活兒也因肺功能障礙需長期(數(shù)月～數(shù)年)依賴氧氣或呼吸機(jī)治療,嚴(yán)重影響早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量,因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前仍無有效的干預(yù)措施,因此探討高氧機(jī)械通氣致BPD的發(fā)病機(jī)制已成為當(dāng)今新生兒領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。 根據(jù)病理學(xué)特點(diǎn)BPD大體上可分為兩種病變,一是炎性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的“傳統(tǒng)BPD”,表現(xiàn)為肺組織內(nèi)白細(xì)胞浸潤、肺氣腫、肺不張以及肺纖維化改變;二是肺發(fā)育阻滯為主要表現(xiàn)的“新型BPD”,表現(xiàn)為肺泡隔形成減少、微血管發(fā)育障礙、肺泡上皮增殖受抑制等。研究表明,氧自由基衍生物、炎癥反應(yīng)、機(jī)械通氣能夠損傷肺上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制表面活性物質(zhì)功能,抑制出生后肺泡、小呼吸道和小血管的發(fā)育,從而影響肺的成熟。炎癥和氧自由基產(chǎn)物均可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator induced lung injury,VILI)是機(jī)械通氣過程中的一個(gè)嚴(yán)重并發(fā)癥,由氣壓傷、容積傷、不張傷及生物傷誘發(fā)肺損傷,隨后發(fā)生BPD。 肺發(fā)育由刺激和抑制因素之間的平衡引起,二個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器是糖皮質(zhì)激素和轉(zhuǎn)化生長因子-β。近年來隨著轉(zhuǎn)化生長因子-β_1(Transforming growthfactor-β_1,TGF-β_1)的深入研究,它在肺泡損傷、肺微血管發(fā)育受阻中的作用倍受關(guān)注。TGF-β_1是調(diào)節(jié)肺發(fā)育、細(xì)胞分裂、細(xì)胞外基質(zhì)重建、呼吸道重建和調(diào)控炎癥的主要調(diào)控器,這些作用共同促進(jìn)BPD的發(fā)生,它參與肺損傷和修復(fù)相反兩方面的機(jī)制,即它誘導(dǎo)了凋亡、感染、纖維化和肺泡重塑。它和其他細(xì)胞因子相互影響,對肺的發(fā)生、發(fā)展起著重要的調(diào)控作用。 隨著人們對細(xì)胞凋亡在肺損傷機(jī)制中作用的關(guān)注,線粒體凋亡途徑成為目前研究的熱點(diǎn),凋亡及其他形式的細(xì)胞死亡途徑中,線粒體通路是一個(gè)關(guān)鍵性步驟,在多種死亡模型中細(xì)胞色素C(Ccytochrome C,Cytc)從線粒體釋放至胞質(zhì)是引發(fā)凋亡的關(guān)鍵步奏。研究證實(shí),肺組織細(xì)胞凋亡與急性肺損傷發(fā)生,發(fā)展密切相關(guān),因此,探索早產(chǎn)兒BPD發(fā)生、發(fā)展中肺組織細(xì)胞的線粒體凋亡途徑規(guī)律及調(diào)控機(jī)制,不僅可以完善肺泡發(fā)育障礙的發(fā)生機(jī)制,并可尋求新的干預(yù)措施。 本實(shí)驗(yàn)利用新生兔BPD模型,觀察支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolarlavage fluid,BALF)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺泡、肺微血管改變及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的演變過程,同時(shí),應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription-polymerase chain raction,RT-PCR)及脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的X-dUTP缺口末端標(biāo)記(Terminaldeoxynucleotide transferase- mediated X-dUTPnick end labeling,TUNEL)方法檢測肺組織TGF-β_1、Cyt c的蛋白及mRNA的動態(tài)表達(dá)及細(xì)胞凋亡指數(shù),以探討①高氧吸入并機(jī)械通氣致BPD新生兔肺損傷的影響;②轉(zhuǎn)化生長因子β_1在肺損傷機(jī)制中的雙重作用;③線粒體/細(xì)胞色素C凋亡途徑在肺組織細(xì)胞凋亡的作用。 實(shí)驗(yàn)材料及方法 1動物模型 日齡3～5天的新生新西蘭兔96只,體質(zhì)量為58.4±9.9 g。隨機(jī)取24只為為正常對照組,給予空氣吸入,未上呼吸機(jī)。余72只在西門子900C呼吸機(jī)上進(jìn)行機(jī)械通氣(Mechanical ventilation.,MV)(定壓模式),吸氧濃度為900 ml/L,隨機(jī)分配在高吸氣峰壓(HPIP=2.45 kPa)、中吸氣峰壓(MPIP=1.77 kPa)、低吸氣峰壓(LPIP=0.98 kPa)三組,每組24只,呼吸末正壓(Positive end expiratorypressure,PEEP)均為0.294kPa、呼吸頻率均為50次/min、吸氣時(shí)間均為0.33s。 2標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)方法 每組動物分別于通氣開始后的1、3、6小時(shí)(h)三個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只,切斷頸總動脈放血處死動物,正常對照組也在相同時(shí)間點(diǎn)同樣處死,行左肺支氣管肺泡灌洗,用BALF作白細(xì)胞計(jì)數(shù),中性分葉核細(xì)胞計(jì)數(shù)。取右肺中葉組織,RT—PCR檢測肺組織TGF-β_1、Cyt C mRNA的表達(dá)。右肺下葉用來行免疫組織化學(xué)法檢測肺組織TGF-β_1、CytC蛋白的表達(dá),同時(shí)光鏡、電鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)改變及TUNEL法檢測肺組織細(xì)胞凋亡。 結(jié)果 1.高氧并機(jī)械通氣對新生兔一般狀態(tài)的影響 正常新生兔精神好,活動好,反應(yīng)靈敏,呼吸平穩(wěn),無發(fā)紺,膚色紅潤。通氣新生兔撤機(jī)后精神差,反應(yīng)差,肢體活動少,出現(xiàn)不同程度呼吸困難和發(fā)紺,以低壓6h組明顯,其次是高壓6h組,中壓1h組癥狀最輕。 2.各組新生兔肺BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性分葉核細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化 隨著通氣的進(jìn)行,HPIP時(shí)肺組織反應(yīng)較強(qiáng),BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈增加趨勢,6h最為明顯,均數(shù)最大,其次為LPIP,MPIP 3h到6h呈下降趨勢,HPIP中性分葉核細(xì)胞計(jì)數(shù)3h最高,LPIP 6h明顯增高,結(jié)合病理切片肺微血管變化和肺纖維增生觀察結(jié)果,考慮高氧機(jī)械通氣致炎癥反應(yīng)可能是肺微血管損傷的一個(gè)始動環(huán)節(jié),由此導(dǎo)致的毛細(xì)血管閉塞是肺微血管減少的一個(gè)重要原因,成纖維細(xì)胞的異常增生也始于炎癥反應(yīng)最顯著階段。 3.病理結(jié)果 光鏡觀察:正常新生兔肺泡形態(tài)較規(guī)則,大小較一致,肺泡間隔無增厚。通氣新生兔早期微血管發(fā)生炎性反應(yīng),隨時(shí)間延長,微血管炎性反應(yīng)加重,血管腔被中性粒細(xì)胞浸潤和壞死的內(nèi)皮細(xì)胞堵塞,間質(zhì)出現(xiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血,其周圍的成纖維細(xì)胞呈增生改變,最后產(chǎn)生大量膠原纖維、毛細(xì)血管閉塞,致使氣血屏障增厚,3h時(shí)肺泡腔稍擴(kuò)大,肺泡和毛細(xì)血管數(shù)目減少,6h時(shí)減少更明顯,肺泡腔變狹長,甚至出現(xiàn)肺泡分隔增寬,肺間質(zhì)細(xì)胞增多,毛細(xì)血管閉塞,以高壓力組明顯,低壓組次之,低壓力組以肺泡大小不均和萎陷、肺葉內(nèi)局部肺不張、透明膜形成較明顯。 電鏡觀察:正常新生兔肺微血管較豐富,血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整,基底膜連續(xù),血?dú)馄琳辖Y(jié)構(gòu)清晰,可見細(xì)胞連接。Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。通氣組1h血管擴(kuò)張,肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,肺間質(zhì)內(nèi)可見多形核白細(xì)胞浸潤。6h時(shí)毛細(xì)血管明顯減少,血管基底膜增厚,部分血管腔被炎細(xì)胞堵塞,肺間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤增多,膠原纖維增生,肺泡腔變窄長,Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞線粒體腫脹、板層小體破壞,Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞向Ⅰ型轉(zhuǎn)化及壞死。上述改變以高壓組及低壓組明顯,中壓組變化稍小,且低壓組肺泡腔受壓,變窄長,毛細(xì)血管閉塞較明顯。線粒體形態(tài)的動態(tài)變化與細(xì)胞凋亡同一時(shí)相。 4.肺組織TGF-β_1蛋白含量及mRNA表達(dá)的動態(tài)變化 通氣肺組織中TGF-β_1 mRNA 1h增加,3h達(dá)高峰,高吸氣峰壓組水平最高,與其它組比較有意義,P＜0.05。TGF-β_1蛋白表達(dá)3h增加,6h達(dá)高峰,高吸氣峰壓組最顯著,四組間比較有顯著性差異,P＜0.01。蛋白表達(dá)高峰稍遲于基因表達(dá),TGF-β_1蛋白表達(dá)灰度值(該值越低,表達(dá)越強(qiáng))與WBC呈負(fù)相關(guān),r=-0.612,P=0.000,說明TGF-β_1蛋白表達(dá)與WBC呈正相關(guān)關(guān)系。 5.肺組織Cyt C蛋白含量及mRNA表達(dá)的動態(tài)變化 隨通氣時(shí)間延長,肺組織Cytc mRNA表達(dá)增加及釋放增加,以高吸氣峰壓細(xì)胞牽張傷所致表達(dá)最顯著,隨時(shí)間延長低吸氣峰壓不張傷致CytcmRNA表達(dá)增高及Cytc釋放增加最明顯。Cytc蛋白表達(dá)與凋亡指數(shù)呈正相關(guān),r=0.747,P=0.000。與WBC呈正相關(guān),r=0.628,P=0.000。 結(jié)論 1.未成熟肺高氧機(jī)械通氣后出現(xiàn)肺泡分隔及數(shù)目減少、肺泡化程度減低、毛細(xì)血管減少到閉塞、肺纖維化的特點(diǎn),且高吸氣峰壓細(xì)胞牽張傷所致?lián)p傷較重。 2.未成熟肺機(jī)械通氣后高吸氣峰壓細(xì)胞牽張傷致炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈,隨時(shí)間延長,低吸氣峰壓不張傷致肺組織出現(xiàn)較重的炎癥性損傷。 3.高氧機(jī)械通氣氧化應(yīng)激致TGF-β_1表達(dá)增高,以高吸氣峰壓最明顯,初期促進(jìn)肺泡及血管發(fā)育,進(jìn)而抑制。 4.未成熟肺高氧機(jī)械通氣后肺組織Cytc表達(dá)增高,以高吸氣峰壓牽張傷最顯著,隨時(shí)間延長低吸氣峰壓不張傷表達(dá)增高最明顯。Cytc表達(dá)與AEC-Ⅱ凋亡時(shí)線粒體形態(tài)的動態(tài)變化相關(guān)。 5機(jī)械通氣致線粒體合成、釋放大量Cytc到胞質(zhì),致氧化應(yīng)激反應(yīng),同時(shí)誘發(fā)caspase活化級聯(lián),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R722

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