【摘要】： 第一部分人偏肺病毒感染人肺上皮細胞后Toll樣受體的表達 目的觀察人偏肺病毒感染人肺上皮細胞后Toll樣受體表達變化及其信號通路的功能,探討hMPV誘導氣道炎癥的部分機制。 方法hMPV感染體外培養(yǎng)的人肺上皮細胞株A549,檢測病毒在A549細胞中的生長曲線,并通過RT-PCR,real-time RT-PCR方法檢測細胞TLRs mRNA的表達,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清干擾素-α及腫瘤壞死因子-α的表達。 結果(1)hMPV可在A549細胞中復制,感染后3天達高峰105.2TCID50/mL。(2)RT-PCR結果提示:hMPV感染A549細胞6小時后大部分TLRs的表達均上調。(3)定量PCR結果提示:hMPV感染A549細胞后TLR3-4,TLR7-9的表達增高,且有時間依賴性,而紫外滅活的hMPV刺激細胞后TLRs表達無明顯變化。(4)ELISA結果提示hMPV 1感染后24小時,IFN-α及TNF-α的表達均明顯升高。 結論人偏肺病毒感染A549細胞后可上調Toll樣受體表達,其誘導的炎性反應與部分Toll樣受體介導的信號轉導途徑有關。 第二部分人偏肺病毒感染小鼠肺內Toll樣受體表達及PolyI:C對病毒感染的影響 目的探討人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后肺組織Toll樣受體表達變化及PolyI:C對病毒復制的影響。 方法實驗分為hMPV感染組、PolyI:C+hMPV組、polyI:C+DMEM組、DMEM對照組,均于滴鼻后1、3、5、7、9、16天處死小鼠,取肺組織用于病毒滴度測定,病理檢查,通過RT-PCR,real-time RT-PCR方法檢測小鼠肺組織TLRs mRNA的表達。 結果(1)PolyI:C+hMPV組與hMPV感染組相比,病毒在小鼠肺內復制水平明顯減低,僅在感染后第5天及第7天檢測到病毒;病理結果亦提示肺部炎癥明顯減輕。(2)RT-PCR結果提示:hMPV感染組小鼠與DMEM對照組相比,肺組織內大部分TLRs mRNA表達均升高。(3)real-time PCR結果提示:hMPV感染后小鼠肺組織TLR7-8 mRNA增高最為顯著,且有時間依賴性;滴鼻后24小時PolyI:C+hMPV組TLR3的表達明顯升高。 結論人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后,可上調小鼠肺組織Toll樣受體表達,其中TLR7/8通路可能在啟動天然免疫應答中起著重要作用; PolyI:C可通過早期活化TLR3,抑制hMPV在小鼠肺內的復制,并減輕肺部炎癥。
【圖文】：

感染后5-6天逐漸發(fā)展為細胞脫落、漂�。桓腥竞�5-6天CPE可達75%左右。hMPV感染A549細胞后，細胞也于感染后3天出現(xiàn)典型的細胞病變，表現(xiàn)為融合，拉網(wǎng)狀改變（圖1-1）。圖 1-1 細胞病變效應 （×200）Fig 1-1. The cytopathogenic effectA Normal Vero-E6 cell B CPE of Vero-E6 cell post infected with hMPVC Normal A549 cell D CPE of A549 cell post infected with hMPV

IFA檢測中未感染細胞在熒光顯微鏡下呈紅色，，而感染細胞則可見特異性的綠色熒光。將感染后3天的A549細胞進行間接免疫熒光檢測，熒光顯微鏡下觀察到特異性綠色熒光，而未感染病毒的A549細胞則未觀察到綠色熒光（圖1-2）。圖 1-2 間接免疫熒光法檢測 A549 細胞中的 hMPVFig1- 2. The IFA assay in A549 cells infected hMPV.A Negative control A549 cells with IFA-negative stainingB hMPV infected A549 cells with obvious IFA-positive staining2.3 hMPV 在 A549 細胞中的生長曲線A549細胞感染hMPV后病毒滴度逐漸升高，感染后1-7天病毒滴度分別為：103.5TCID50/mL、104.6TCID50/mL、105.2TCID50/mL、105.0TCID50/mL、104.4TCID50/mL、103.9TCID50/mL、103.7TCID50/mL。可以看出于感染后第3天時達到高峰為105.2TCID50/mL，之后逐漸降低，但仍在一定時間內維持較高水平，第7天仍可達103.7TCID50/mL(圖1-3)。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R725.6

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6 林仲e

本文編號：2604239