【摘要】： 第一部分人偏肺病毒感染人肺上皮細(xì)胞后Toll樣受體的表達(dá) 目的觀察人偏肺病毒感染人肺上皮細(xì)胞后Toll樣受體表達(dá)變化及其信號(hào)通路的功能,探討hMPV誘導(dǎo)氣道炎癥的部分機(jī)制。 方法hMPV感染體外培養(yǎng)的人肺上皮細(xì)胞株A549,檢測(cè)病毒在A549細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線,并通過(guò)RT-PCR,real-time RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞TLRs mRNA的表達(dá),ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清干擾素-α及腫瘤壞死因子-α的表達(dá)。 結(jié)果(1)hMPV可在A549細(xì)胞中復(fù)制,感染后3天達(dá)高峰105.2TCID50/mL。(2)RT-PCR結(jié)果提示:hMPV感染A549細(xì)胞6小時(shí)后大部分TLRs的表達(dá)均上調(diào)。(3)定量PCR結(jié)果提示:hMPV感染A549細(xì)胞后TLR3-4,TLR7-9的表達(dá)增高,且有時(shí)間依賴性,而紫外滅活的hMPV刺激細(xì)胞后TLRs表達(dá)無(wú)明顯變化。(4)ELISA結(jié)果提示hMPV 1感染后24小時(shí),IFN-α及TNF-α的表達(dá)均明顯升高。 結(jié)論人偏肺病毒感染A549細(xì)胞后可上調(diào)Toll樣受體表達(dá),其誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)與部分Toll樣受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。 第二部分人偏肺病毒感染小鼠肺內(nèi)Toll樣受體表達(dá)及PolyI:C對(duì)病毒感染的影響 目的探討人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后肺組織Toll樣受體表達(dá)變化及PolyI:C對(duì)病毒復(fù)制的影響。 方法實(shí)驗(yàn)分為hMPV感染組、PolyI:C+hMPV組、polyI:C+DMEM組、DMEM對(duì)照組,均于滴鼻后1、3、5、7、9、16天處死小鼠,取肺組織用于病毒滴度測(cè)定,病理檢查,通過(guò)RT-PCR,real-time RT-PCR方法檢測(cè)小鼠肺組織TLRs mRNA的表達(dá)。 結(jié)果(1)PolyI:C+hMPV組與hMPV感染組相比,病毒在小鼠肺內(nèi)復(fù)制水平明顯減低,僅在感染后第5天及第7天檢測(cè)到病毒;病理結(jié)果亦提示肺部炎癥明顯減輕。(2)RT-PCR結(jié)果提示:hMPV感染組小鼠與DMEM對(duì)照組相比,肺組織內(nèi)大部分TLRs mRNA表達(dá)均升高。(3)real-time PCR結(jié)果提示:hMPV感染后小鼠肺組織TLR7-8 mRNA增高最為顯著,且有時(shí)間依賴性;滴鼻后24小時(shí)PolyI:C+hMPV組TLR3的表達(dá)明顯升高。 結(jié)論人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后,可上調(diào)小鼠肺組織Toll樣受體表達(dá),其中TLR7/8通路可能在啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答中起著重要作用; PolyI:C可通過(guò)早期活化TLR3,抑制hMPV在小鼠肺內(nèi)的復(fù)制,并減輕肺部炎癥。
【圖文】：

感染后5-6天逐漸發(fā)展為細(xì)胞脫落、漂�。桓腥竞�5-6天CPE可達(dá)75%左右。hMPV感染A549細(xì)胞后，細(xì)胞也于感染后3天出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，表現(xiàn)為融合，拉網(wǎng)狀改變（圖1-1）。圖 1-1 細(xì)胞病變效應(yīng) （×200）Fig 1-1. The cytopathogenic effectA Normal Vero-E6 cell B CPE of Vero-E6 cell post infected with hMPVC Normal A549 cell D CPE of A549 cell post infected with hMPV

IFA檢測(cè)中未感染細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈紅色，，而感染細(xì)胞則可見(jiàn)特異性的綠色熒光。將感染后3天的A549細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，熒光顯微鏡下觀察到特異性綠色熒光，而未感染病毒的A549細(xì)胞則未觀察到綠色熒光（圖1-2）。圖 1-2 間接免疫熒光法檢測(cè) A549 細(xì)胞中的 hMPVFig1- 2. The IFA assay in A549 cells infected hMPV.A Negative control A549 cells with IFA-negative stainingB hMPV infected A549 cells with obvious IFA-positive staining2.3 hMPV 在 A549 細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線A549細(xì)胞感染hMPV后病毒滴度逐漸升高，感染后1-7天病毒滴度分別為：103.5TCID50/mL、104.6TCID50/mL、105.2TCID50/mL、105.0TCID50/mL、104.4TCID50/mL、103.9TCID50/mL、103.7TCID50/mL�？梢钥闯鲇诟腥竞蟮�3天時(shí)達(dá)到高峰為105.2TCID50/mL，之后逐漸降低，但仍在一定時(shí)間內(nèi)維持較高水平，第7天仍可達(dá)103.7TCID50/mL(圖1-3)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R725.6

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6 林仲e

本文編號(hào)：2604239