【摘要】：新生兒篩查(Newbornscreening,NBS)是預(yù)防醫(yī)學(xué)的一項(xiàng)重要措施,可以在患兒尚未出現(xiàn)臨床癥狀前通過體內(nèi)代謝變化進(jìn)行及時(shí)篩查,及早預(yù)防與治療,有效規(guī)避患兒重要臟器發(fā)生損害,保障兒童正常的體格與智能發(fā)育。本研究針對(duì)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)中公布的兩項(xiàng)核心疾病重癥聯(lián)合免疫缺陷病(Severe combined immunodeficiency,SCID)和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(Congenital adrenal hyperplasia,CAH)進(jìn)行了基因檢測方法的探究,同時(shí)發(fā)展了一種血斑DNA的快速提取方法,開展了實(shí)時(shí)PCR快速檢測方法的研究。第一章緒論部分,依次介紹了新生兒篩查的目的、意義、流程、國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀、優(yōu)勢(shì)及實(shí)時(shí)熒光PCR方法的簡介和原理。最后對(duì)本文的研究內(nèi)容進(jìn)行了介紹,重點(diǎn)闡述了如何將實(shí)時(shí)PCR技術(shù)應(yīng)用于新生兒疾病的篩查中。第二章探究與優(yōu)化血斑DNA提取的方法,通過對(duì)四種不同提取方法的比對(duì)與優(yōu)化,最后確定利用chelex100的方法提取血斑標(biāo)本。該方法具有簡單、高效、成本低等優(yōu)點(diǎn),適合于快速提取血斑。第三章描述了單管多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系,用于定量血斑標(biāo)本中的TRECs,以實(shí)現(xiàn)篩查新生兒中SCID檢測。體系包含一個(gè)參照基因RPP30與一個(gè)檢測對(duì)象TREC,利用RPP30對(duì)TRECs進(jìn)行相對(duì)定量,計(jì)算新生兒在1000,000個(gè)外周血單核細(xì)胞中TRECs的含量,從而確定正常新生兒中TRECs的cut-off值,若標(biāo)本檢測結(jié)果中TRECs的含量低于cut-off值則判定為陽性標(biāo)本。第四章描述了兩輪PCR擴(kuò)增體系,檢測CYP21A2基因常見的突變,CYP21A2突變是引起CAH主要原因。由于CYP21A2基因與CYP21A1P基因高度同源,所以需要通過預(yù)擴(kuò)增體系實(shí)現(xiàn)CYP21A2基因的特異擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增體系的建立實(shí)現(xiàn)了對(duì)低質(zhì)量、低濃度的血斑標(biāo)本進(jìn)行長片段擴(kuò)增,擴(kuò)增子約3.5kb。第二輪體系利用多色探針熔解曲線分析技術(shù)同時(shí)對(duì)中國人群中13個(gè)常見的突變進(jìn)行檢測。通過檢測524份隨機(jī)的血斑標(biāo)本,基因分型結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測序結(jié)果一致為100%。檢測16份臨床標(biāo)本,體系檢測出的點(diǎn)突變基因分型與臨床信息一致,其中3份標(biāo)本攜帶大片段缺失,超出了體系檢測范圍。該體系簡便快捷、易于使用且基因分型結(jié)果準(zhǔn)確,適合新生兒CYP21A2基因突變檢測。
【圖文】：

擴(kuò)增兄ＰＰ３０基因?qū)Σ煌崛》椒ǖ男阅苓M(jìn)行考察和比較。逡逑每種提取方法均對(duì)６片直徑為３ｍｍ的干血斑進(jìn)行提取，每份標(biāo)本使用實(shí)時(shí)逡逑熒光定量ＰＣＲ的方法做兩個(gè)平行孔。圖２－１則是以四種提取方法為橫坐標(biāo)，以逡逑干血斑標(biāo)本ＤＮＡ的Ｃｑ值為縱坐標(biāo)，比較四種方法的穩(wěn)定性和提取濃度，由ＢＯＸ逡逑圖和散點(diǎn)圖可以看出，Ｃｈｅｌｅｘ邋１００的提取方法最穩(wěn)定，Ｃｑ值最小，濃度最高。逡逑３２，邐邋３２，邐逡逑３１－邐．邐３１－邐．逡逑３０＇邐３０－邐？逡逑｜邋２９邋－邐Ｔ邐２９－邐？逡逑｜邋２８－ｆ＝＾邐２８－．．：：邐逡逑ｏ邋２７－邋。邐｜，－＾￣邋２７－邐？邋？？？邋？邐：邋：邋ｉ逡逑？邋２６N．Ｔ邋．邋ｔ＝＝ｄ邋２６－邋：．邐．邐：邋ｉ邋：逡逑°邐２５邐｛邐２５邐？？？？？？？？邐．逡逑２４邋－邐２４－邐＊逡逑２３邐１邐１邐１邐１邐邋２３邐１邐＞邐＇邐邐邐逡逑儀器自動(dòng)提取熱喊法（＾６以１００堿性？￡０邋２００儀器自動(dòng)提取熱y法（＾６＾１００喊性？日０邋２００逡逑圖２－１：干血斑不同提取方法比較逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１：邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｍｅｔｈｏｄｓ邋ｆｏｒ邋ｄｒｉｅｄ邋ｂｌｏｏｄ邋ｓｐｏｔｓ逡逑這四種提取方法中提取時(shí)間最短的方法為堿性ＰＥＧ邋２００方法，但該方法與逡逑Ｃｈｅｌｅｘ邋１００方法比對(duì)提取效率較低，綜合各項(xiàng)因素，Ｃｈｅｌｅｘ邋１００方法提取血斑標(biāo)逡逑本為最優(yōu)方法

每位志愿者的提取兩份直徑為３ｍｍ的干血斑，共提�。镀睆綖椋常咤义系母裳摺⑻崛〕龅臉�(biāo)本使用實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ的方法考察濃度，每份標(biāo)本逡逑做兩個(gè)平行管。最終結(jié)果如圖２－２所示，，標(biāo)本濃度集中在ｌＯＯｃｏｐｉｅｓ／＾Ｌ－ｌＯＯＯ逡逑ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬ邋之間。逡逑４Ｆ邐邋３５，邐逡逑ｆ“、邐Ｙ＝－３．５３０Ｘ邋Ｌｏｇ（ｘ）＋３３．８３６逡逑３０邋？邋＼邋＝逡逑０邐１０邐２０邐３０邐４０邐５０邐１0、逡逑Ｃｙｃｌｅ邋Ｎｕｍｂｅｒ邐Ｃｏｎｃ（ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬ）逡逑圖２－２：血斑標(biāo)本濃度考察逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２：邋Ｓｔｕｄｙ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｌｏｏｄ邋ｓｐｏｔ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑２２逡逑
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2604092