【摘要】： 特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)是兒科最常見的出血性疾病。目前普遍認為ITP發(fā)病機制主要是因為免疫因素致機體產(chǎn)生血小板相關(guān)抗體，使血小板及巨核細胞(megakaryocyte，MK)被單核-巨噬細胞系統(tǒng)所清除，從而導(dǎo)致血小板減少。檢查發(fā)現(xiàn)，雖然ITP骨髓巨核細胞數(shù)正常或增多，但產(chǎn)血小板的巨核細胞減少，幼稚顆粒型的巨核細胞明顯增多，提示ITP患者存在有巨核細胞成熟障礙。臨床通常將其病程是否超過6個月分為急性ITP(acute idiopathic thrombocytopenic purpura，AITP)與慢性ITP(chronic idiopathic thrombocytopenic purpura，CITP)兩型。AITP與CITP在發(fā)病早期鑒別存在難度，從而無法在疾病早期分別給予針對性的積極有效治療。部分CITP患兒對糖皮質(zhì)激素或大劑量靜脈丙種球蛋白治療反應(yīng)差，病情遷延反復(fù)，發(fā)展為難治性ITP，給患兒身心健康造成極大的威脅。 巨核細胞是血小板的前體細胞，研究巨核細胞的改變對了解血小板減少性疾病發(fā)生的原因及其鑒別診斷、預(yù)后判斷與治療方案的選擇有很大的科研價值和臨床意義。血小板生成包括造血干細胞增殖分化產(chǎn)生巨核細胞，巨核細胞的分化成熟，血小板的生成，多個細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子參與了該過程。在巨核系造血的早期階段，主要由血小板生成素(thrombopoietin，TPO)及白細胞介素1(interleukin 1，IL-1)、IL-3調(diào)控；在分化的后期有TPO、IL-6和IL-11參與。GATA-1與紅細胞系核因子2(nuclear factor erythroid 2，NF-E2)是調(diào)節(jié)造血細胞基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)，二者在調(diào)控巨核細胞發(fā)育分化方面起重要作用。 IL-11是重要的造血調(diào)節(jié)因子，可刺激巨核系造血，促進巨核細胞的成熟。但目前尚未有重組人白細胞介素11(recombinant human interleukin 11，rhIL-11)治療ITP等自身免疫性血小板減少性疾病的確切資料。而IL-11是否參與巨核細胞生長調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與調(diào)控巨核細胞生成的轉(zhuǎn)錄因子之間有無關(guān)系尚未可知，目前無相關(guān)研究資料。 本研究分三部分內(nèi)容，首先，在rhTPO、rhIL-3、rhIL-6等細胞因子作用下，對骨髓巨核系祖細胞集落進行體外無血清半固體培養(yǎng)。通過觀察對照組及ITP患兒巨核系祖細胞的生長，并比較ITP不同病程中巨核系祖細胞生長的差異，探討巨核細胞生成在ITP發(fā)病機制中的作用。第二，觀察rhIL-11聯(lián)合其它因子對對照組和CITP組巨核系祖細胞生長成熟的作用，并比較在無血清液體培養(yǎng)條件下對單個核細胞(mononuclear cells，MNC)以及CD41~+細胞的增殖效力，旨在探討rhIL-11在CITP治療中的作用。第三，觀察rhIL-11誘導(dǎo)Dami細胞GATA-1和NF-E2的mRNA及蛋白表達變化，旨在闡明rhIL-11對巨核細胞生長調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 第一部分ITP患兒骨髓巨核系祖細胞體外培養(yǎng)的研究 對象和方法 1．初治ITP患兒52例，分別于治療前抽取骨髓3ml～4ml進行檢驗。其中AITP患兒27例，CITP患兒25例。同時，對25例CITP患兒給予口服強的松治療2.0mg／(kgd)，療程不超過28天。根據(jù)療效不同分為激素有效組和激素?zé)o效組。對照組為骨髓檢查三系造血功能正常，排除血液系統(tǒng)疾病兒童10例。2．骨髓涂片巨核細胞(MK)標化計數(shù)。3．骨髓MNC分離：用Ficoll密度梯度分離法分離骨髓MNC。4．骨髓巨核系祖細胞的半固體培養(yǎng)：骨髓MNC接種于含有rhTPO、rhIL-3、rhIL-6無血清膠原培養(yǎng)基培養(yǎng)14天。5．巨核系祖細胞的染色鑒定：以CD41結(jié)合的堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase，APAAP)橋聯(lián)酶標法染色鑒定半固體培養(yǎng)的巨核細胞集落形成單位(megakaryocyte colony forming unit，CFU-MK)和巨核細胞爆式集落形成單位(megakaryocyte burst forming unit，BFU-MK)。6．用統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果 1．各組骨髓MK數(shù)的比較：AITP組骨髓MK較對照組顯著增高(P＜0.05)，CITP組MK較對照組顯著增高(P＜0.05)，AITP組與CITP組相比，MK差異無顯著性(P＞0.05)。25例CITP患兒中，17例激素有效組MK均高于對照組和8例激素?zé)o效組(均為P＜0.05)；激素?zé)o效組MK低于對照組(P＜0.05)。 2．各組骨髓巨核系祖細胞集落數(shù)的比較：AITP組CFU-MK和BFU-MK均高于對照組(均為P＜0.05)，CITP組CFU-MK和BFU-MK與對照組相比差異無顯著性(均為P＞0.05)，CITP患兒中激素有效組CFU-MK和BFU-MK均高于對照組和激素?zé)o效組(均為P＜0.05)；激素?zé)o效組CFU-MK和BFU-MK均低于對照組(均為P＜0.05)。 3．相關(guān)性分析：AITP組CFU-MK和MK有顯著相關(guān)性(r_s=0.65，P＜0.01)，BFU-MK和MK有顯著相關(guān)性(r_s=0.71，P＜0.01)，CFU-MK和BFU-MK有顯著相關(guān)性(r_s=0.74，P＜0.01)。CITP組CFU-MK和MK有顯著相關(guān)性(r_s=0.90，P＜0.01)，BFU-MK和MK有顯著相關(guān)性(r_s=0.98，P＜0.01)，CFU-MK和BFU-MK有顯著相關(guān)性(r_s=0.92，P＜0.01)。 第二部分rhIL-11對慢性ITP患兒骨髓巨核系祖細胞體外培養(yǎng)的作用 對象和方法 1．取第一部分中23例CITP患兒骨髓，其中15例激素有效患兒為激素有效組，8例激素?zé)o效患兒為激素?zé)o效組，取第一部分中10例對照組兒童骨髓為對照組。2．骨髓MNC分離：用Ficoll密度梯度分離法分離骨髓MNC。3．骨髓巨核系祖細胞的半固體培養(yǎng)：骨髓MNC接種于無血清膠原培養(yǎng)基培養(yǎng)14天，培養(yǎng)體系中包含rhIL-11，，或者rhTPO、rhIL-3、rhIL-6，或者rhTPO、rhIL-3、rhIL-6、rhIL-11。4．巨核系祖細胞的染色鑒定：以CD41單克隆抗體結(jié)合的APAAP橋聯(lián)酶標法染色鑒定半固體培養(yǎng)的CFU-MK和BFU-MK。5．骨髓巨核系祖細胞的液體培養(yǎng)：無血清液體培養(yǎng)各組骨髓MNC，培養(yǎng)體系中包含rhIL-11，或者rhTPO、rhIL-3、rhIL-6，或者rhTPO、rhIL-3、rhIL-6、rhIL-11。6．MNC的檢測：無血清液體培養(yǎng)第0、7、14天，白細胞計數(shù)板行MNC計數(shù)。7．CD41~+細胞率的檢測：無血清液體培養(yǎng)第14天，流式細胞儀測定CD41~+細胞率。8．用統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果 1．rhIL-11聯(lián)合TPO等對各組骨髓巨核系祖細胞集落生長的作用：rhIL-11可促進對照組CFU-MK和BFU-MK生成(均為P＜0.01)，并可促進激素有效組CFU-MK和BFU-MK生成(均為P＜0.01)；對激素?zé)o效組CFU-MK和BFU-MK則無明顯影響(均為P＞0.05)。 2．rhIL-11聯(lián)合TPO等對各組MNC的增殖作用：在培養(yǎng)第7、14天，rhIL-11對各組MNC均無顯著增殖作用(均為P＞0.05)。 3．rhIL-11聯(lián)合TPO等對各組CD41~+細胞的增殖作用：培養(yǎng)14天，rhIL-11可顯著擴增對照組、激素有效組CD41~+細胞百分率(均為P＜0.01)，對激素?zé)o效組無顯著增殖作用(P＞0.05)。 第三部分rhIL-11誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和NF-E2在Dami細胞的表達 對象和方法 1．Dami細胞生長曲線的建立：取對數(shù)生長期Dami細胞，連續(xù)培養(yǎng)7天，每天進行細胞計數(shù)，繪制生長曲線。2．rhIL-11對Dami細胞的增殖作用：取對數(shù)生長期Dami細胞，CCK-8(Cell Counting Kit-8)法分別于培養(yǎng)0h、24h、48h、72h進行檢測。3．Dami細胞IL-11Rα的表達：免疫組化法檢測Dami細胞IL-11Rα的表達。4．Dami細胞IL-11Rα蛋白表達：Western blot法檢測Dami細胞IL-11Rα蛋白表達。5．Dami細胞GATA-1和NF-E2的mRNA表達：用rhIL-11(50ng／ml)刺激Dami細胞0h、1h、2h、4h，RT-PCR法對rhIL-11誘導(dǎo)的Dami細胞GATA-1和NF-E2的mRNA表達進行檢測。6．Dami細胞GATA-1和NF-E2蛋白表達：用rhIL-11(50ng／ml)刺激Dami細胞1h、2h、4h，Western blot法分析rhIL-11誘導(dǎo)的Dami細胞GATA-1和NF-E2蛋白表達。7．用統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果 1．rhIL-11對Dami細胞增殖的影響：濃度分別為50ng／ml和100ng／ml的rhIL-11在培養(yǎng)24h、48h、72h對Dami細胞增殖均無促進作用(P＞0.05)。 2．免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，Dami細胞表達IL-11Rα。 3．Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，Dami細胞表達IL-11Rα蛋白。 4．rhIL-11誘導(dǎo)Dami細胞GATA-1和NF-E2的蛋白表達：Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：50ng／ml rhIL-11處理后1h、2h、4h，GATA-1和NF-E2蛋白表達量均高于0h(均為P＜0.01)。 5．rhIL-11誘導(dǎo)Dami細胞GATA-1和NF-E2的mRNA表達：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：50ng／ml rhIL-11處理后1h，GATA-1mRNA表達高于0h(P＜0.01)，但2h、4h GATA-1mRNA表達低于0h(均為P＜0.01)。而在rhIL-11處理后1h、2h、4h，NF-E2mRNA表達均高于0h(均為P＜0.01)，且NF-E2mRNA在1h表達高于2h和4h(均為P＜0.01)。 結(jié)論 1．在發(fā)病早期綜合分析ITP患兒骨髓巨核細胞和體外巨核系祖細胞集落的生成情況，可能有助于AITP和CITP的早期鑒別診斷。 2．部分CITP患兒巨核系祖細胞集落減低，對糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)差，可能存在巨核細胞增生障礙。 3．與TPO等細胞因子聯(lián)合進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，rhIL-11可促進部分CITP患兒骨髓巨核系祖細胞的增殖，提示rhIL-11具有治療CITP的潛在價值；但對巨核系祖細胞具有明顯增殖障礙的部分CITP患兒無明顯作用。 4．rhIL-11可促進Dami細胞GATA-1和NF-E2的mRNA及蛋白表達，提示rhIL-11可能通過誘導(dǎo)這些轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控巨核細胞的增殖和分化。rhIL-11可能是通過與Dami細胞表面的IL-11Rα結(jié)合而發(fā)揮作用的。
【圖文】：

圖1一1骨髓幼稚巨核細胞瑞一姬氏染色(xl000)Figl一 1InmatureMKinbonemarrow，Wright一Giemsa’ 5stain(X1000)圖1一2骨髓產(chǎn)血小板成熟巨核細胞瑞一姬氏染色(xl000)Figl一 2MKwithPlateletreleaseinbonemarrow， Wright一Giemsa’ 5stain(x1000)圖l一3骨髓嗜酸性粒細胞，瑞一姬氏染色(xl000)Figl一 3EosinoPhilinbonemarrow，Wright一Giemsa’ 5stain(X1000)

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本文編號：2600298