【摘要】：背景尼曼-匹克病(NPC1)是一種呈進(jìn)行性加重的疾病,新生兒時(shí)期往往會出現(xiàn)淤膽,逐步表現(xiàn)為肝脾腫大,其中患者出現(xiàn)肝腫大癥狀的比例約為31%。Npc1~(-/-)小鼠與人類的發(fā)病過程及臨床表現(xiàn)非常的相似,早期出現(xiàn)肝脾腫大以及肝功能異常,如堿性磷酸酶及轉(zhuǎn)氨酶均顯著高于Npc1~(+/+)小鼠。由于肝臟細(xì)胞內(nèi)脂類的異常聚集引發(fā)炎癥細(xì)胞浸潤以及肝細(xì)胞功能下降,最終導(dǎo)致肝臟細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡甚至纖維化的發(fā)生。近年來,隨著對Telocytes(TCs)研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其在維持組織穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)組織器官發(fā)育和免疫監(jiān)視方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前,肝臟中TCs的存在已獲得證實(shí),但對TCs的研究大多聚焦在形態(tài)學(xué)研究方面,而關(guān)于Npc1基因突變后對肝臟中TCs的形態(tài)及其功能研究鮮有報(bào)道。因此,本課題以Npc1~(-/-)小鼠(BALB/cNctr-Npc1~(m1N)/J)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,首先明確Npc1基因突變對晚期小鼠肝臟功能及病理變化影響,隨后檢測Npc1基因突變對TCs的形態(tài)學(xué)及其多向分化潛能的影響,上述研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究Npc1基因突變所導(dǎo)致的TCs生物學(xué)活性變化與肝功能異常之間的相互作用機(jī)制提供理論支持。目的明確Npc1基因突變對晚期小鼠肝功能及病理變化影響,并進(jìn)一步研究Npc1基因?qū)Ω闻K中TCs的生物學(xué)活性影響,為深入研究TCs生物學(xué)活性與肝功能之間的相互作用機(jī)制提供理論支持。方法1.通過PCR法對小鼠進(jìn)行基因型鑒定。2.眼內(nèi)眥取血檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性變化。3.取肝組織進(jìn)行石蠟和冷凍切片,通過HE染色和油紅O染色評估肝臟組織的形態(tài)變化和脂肪儲存情況,以及Masson染色評估肝臟組織膠原沉積情況。4.Real-time PCR和Western blotting分別檢測肝臟組織促炎癥因子,白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的mRNA和蛋白水平表達(dá)情況;TUNEL染色評估肝臟組織凋亡情況。5.透射電鏡(TEM)和細(xì)胞免疫熒光染色對TCs進(jìn)行細(xì)胞鑒定。6.改進(jìn)型II型膠原酶消化法提取并培養(yǎng)新生Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)小鼠肝臟原代TCs,利用細(xì)胞差速貼壁法對提取的TCs進(jìn)行純化。定時(shí)在倒置顯微鏡下觀察Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組中TCs的生長狀態(tài),并記錄正常生長狀態(tài)下TCs的形態(tài);通過掃描電鏡(SEM)觀察TCs的形態(tài)。7.通過成脂誘導(dǎo)液、成骨誘導(dǎo)液和成心肌誘導(dǎo)液分別對Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組新生小鼠肝臟TCs誘導(dǎo)培養(yǎng),并用油紅O染色、茜素紅染色和細(xì)胞免疫熒光對誘導(dǎo)后的肝臟TCs進(jìn)行鑒定。結(jié)果1.基因鑒定篩選出新生的Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)小鼠。2.與晚期(P60)Npc1~(+/+)小鼠相比,Npc1~(-/-)小鼠的體重及肝臟系數(shù)顯著降低(P0.001);LDH、ALT及AST活性顯著升高(P0.001)。3.HE染色發(fā)現(xiàn),Npc1~(-/-)小鼠肝臟組織形態(tài)改變明顯,出現(xiàn)大量泡沫細(xì)胞;油紅O染色顯示,Npc1~(-/-)小鼠肝臟脂肪含量顯著降低。4.Real-time PCR顯示,Npc1~(-/-)小鼠肝臟組織IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)均顯著升高(P0.01,P0.05和P0.001),同時(shí),Western blotting也顯示,三個(gè)炎癥因子的蛋白表達(dá)均顯著升高(P0.05,P0.05和P0.01),證實(shí)Npc1~(-/-)小鼠肝臟晚期發(fā)生炎癥反應(yīng);Masson染色未發(fā)現(xiàn)Npc1~(-/-)小鼠肝臟纖維化的發(fā)生;TUNEL染色顯示,Npc1~(-/-)小鼠肝臟組織凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。5.細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示:Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組的TCs細(xì)胞表面標(biāo)記物VimentinCD34、VimentinPDGF-a、Vimentinc-Kit均出現(xiàn)共表達(dá)。6.TEM掃描結(jié)果顯示Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組TCs的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的比例比其他類型的細(xì)胞相對較大,胞體直徑約8-16um。Npc1~(+/+)組TCs細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器十分豐富,如微絲、高爾基體、線粒體、微管、中間絲等結(jié)構(gòu),而Npc1~(-/-)組TCs細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器比例低于Npc1~(+/+)組。7.普通顯微鏡下和SEM掃描結(jié)果顯示Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組TCs的細(xì)胞結(jié)構(gòu)主要由胞體和突起(Telopodes,Tps)構(gòu)成。細(xì)胞的胞體較小,細(xì)胞核根據(jù)Tps的數(shù)量呈梭形、星形或紡錘形。TCs細(xì)胞膜表面凹凸不平,兩組之間的形態(tài)學(xué)無差異。8.油紅O染色、茜素紅染色和細(xì)胞免疫熒光對誘導(dǎo)后的肝臟TCs進(jìn)行鑒定結(jié)果顯示:Npc1~(-/-)組TCs誘導(dǎo)后的陽性率均顯著低于Npc1~(+/+)組。結(jié)論Npc1基因突變導(dǎo)致肝臟組織形態(tài)發(fā)生改變,大量巨噬細(xì)胞聚集引發(fā)炎癥反應(yīng),而炎癥反應(yīng)的發(fā)生可能是引起肝臟細(xì)胞凋亡和肝功能受損的重要原因之一;隨后研究發(fā)現(xiàn)肝臟TCs在誘導(dǎo)條件下可向成脂、成骨、成心肌樣細(xì)胞分化;而Npc1基因突變對肝臟中TCs的多向分化潛能具有抑制作用。
【圖文】：

圖1 NPC1小鼠基因型鑒定結(jié)果雜合型：Npc1+/-；突變型：Npc1-/-。W：野生型引物；M：突變型引物 results of NPC1 mice+; Heterozygote: Npc1+/-; Mutant: Npc1-/-; W: Wild type primers; M: Muta圖2. P60 Npc1+/+和 Npc1-/-小鼠體重、肝臟重量及肝功能的比較分析

附圖圖1 NPC1小鼠基因型鑒定結(jié)果野生型：Npc1+/+；雜合型：Npc1+/-；突變型：Npc1-/-。W：野生型引物；M：突變型引物；Marker：分子量標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Genotyping results of NPC1 miceWild type: Npc1+/+; Heterozygote: Npc1+/-; Mutant: Npc1-/-; W: Wild type primers; M: Mutant primers.
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R725.8

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 任永春;;調(diào)換座位和基因突變的關(guān)系[J];中學(xué)生物教學(xué);2015年Z1期

2 馬曉梅;李洪波;;巧用實(shí)例及概念圖突破“基因突變”中的知識要點(diǎn)[J];中學(xué)生物教學(xué);2015年17期

3 張樹虎;;基于生物學(xué)事實(shí)進(jìn)行概念分步建構(gòu)教學(xué)——以“基因突變”為例[J];中學(xué)生物教學(xué);2016年23期

4 付桂玲;;豐富的探究活動(dòng)打破沉默學(xué)習(xí)[J];中學(xué)生物教學(xué);2017年16期

5 樊向利;;有關(guān)“基因突變”的幾組概念辨析[J];生物學(xué)教學(xué);2008年11期

6 李金安;蔣世祿;夏焦兵;劉永生;陳小兵;楊京舉;黃永海;肖安慶;王學(xué)宏;王彬;劉峰;張建尚;謝國富;蒙庚陽;;基因突變大部分是有害的嗎?——對2011年上海生物卷第8題的討論[J];中學(xué)生物教學(xué);2011年10期

7 周，

本文編號：2594008