【摘要】：背景尼曼-匹克病(NPC1)是一種呈進行性加重的疾病,新生兒時期往往會出現(xiàn)淤膽,逐步表現(xiàn)為肝脾腫大,其中患者出現(xiàn)肝腫大癥狀的比例約為31%。Npc1~(-/-)小鼠與人類的發(fā)病過程及臨床表現(xiàn)非常的相似,早期出現(xiàn)肝脾腫大以及肝功能異常,如堿性磷酸酶及轉氨酶均顯著高于Npc1~(+/+)小鼠。由于肝臟細胞內脂類的異常聚集引發(fā)炎癥細胞浸潤以及肝細胞功能下降,最終導致肝臟細胞出現(xiàn)早期凋亡甚至纖維化的發(fā)生。近年來,隨著對Telocytes(TCs)研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其在維持組織穩(wěn)態(tài)和調節(jié)組織器官發(fā)育和免疫監(jiān)視方面發(fā)揮著關鍵作用。目前,肝臟中TCs的存在已獲得證實,但對TCs的研究大多聚焦在形態(tài)學研究方面,而關于Npc1基因突變后對肝臟中TCs的形態(tài)及其功能研究鮮有報道。因此,本課題以Npc1~(-/-)小鼠(BALB/cNctr-Npc1~(m1N)/J)為實驗動物模型,首先明確Npc1基因突變對晚期小鼠肝臟功能及病理變化影響,隨后檢測Npc1基因突變對TCs的形態(tài)學及其多向分化潛能的影響,上述研究結果為進一步深入研究Npc1基因突變所導致的TCs生物學活性變化與肝功能異常之間的相互作用機制提供理論支持。目的明確Npc1基因突變對晚期小鼠肝功能及病理變化影響,并進一步研究Npc1基因對肝臟中TCs的生物學活性影響,為深入研究TCs生物學活性與肝功能之間的相互作用機制提供理論支持。方法1.通過PCR法對小鼠進行基因型鑒定。2.眼內眥取血檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)的活性變化。3.取肝組織進行石蠟和冷凍切片,通過HE染色和油紅O染色評估肝臟組織的形態(tài)變化和脂肪儲存情況,以及Masson染色評估肝臟組織膠原沉積情況。4.Real-time PCR和Western blotting分別檢測肝臟組織促炎癥因子,白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的mRNA和蛋白水平表達情況;TUNEL染色評估肝臟組織凋亡情況。5.透射電鏡(TEM)和細胞免疫熒光染色對TCs進行細胞鑒定。6.改進型II型膠原酶消化法提取并培養(yǎng)新生Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)小鼠肝臟原代TCs,利用細胞差速貼壁法對提取的TCs進行純化。定時在倒置顯微鏡下觀察Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組中TCs的生長狀態(tài),并記錄正常生長狀態(tài)下TCs的形態(tài);通過掃描電鏡(SEM)觀察TCs的形態(tài)。7.通過成脂誘導液、成骨誘導液和成心肌誘導液分別對Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組新生小鼠肝臟TCs誘導培養(yǎng),并用油紅O染色、茜素紅染色和細胞免疫熒光對誘導后的肝臟TCs進行鑒定。結果1.基因鑒定篩選出新生的Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)小鼠。2.與晚期(P60)Npc1~(+/+)小鼠相比,Npc1~(-/-)小鼠的體重及肝臟系數(shù)顯著降低(P0.001);LDH、ALT及AST活性顯著升高(P0.001)。3.HE染色發(fā)現(xiàn),Npc1~(-/-)小鼠肝臟組織形態(tài)改變明顯,出現(xiàn)大量泡沫細胞;油紅O染色顯示,Npc1~(-/-)小鼠肝臟脂肪含量顯著降低。4.Real-time PCR顯示,Npc1~(-/-)小鼠肝臟組織IL-1β、IL-6和TNF-α表達均顯著升高(P0.01,P0.05和P0.001),同時,Western blotting也顯示,三個炎癥因子的蛋白表達均顯著升高(P0.05,P0.05和P0.01),證實Npc1~(-/-)小鼠肝臟晚期發(fā)生炎癥反應;Masson染色未發(fā)現(xiàn)Npc1~(-/-)小鼠肝臟纖維化的發(fā)生;TUNEL染色顯示,Npc1~(-/-)小鼠肝臟組織凋亡細胞數(shù)量增加。5.細胞免疫熒光染色結果顯示:Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組的TCs細胞表面標記物VimentinCD34、VimentinPDGF-a、Vimentinc-Kit均出現(xiàn)共表達。6.TEM掃描結果顯示Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組TCs的細胞核/細胞質的比例比其他類型的細胞相對較大,胞體直徑約8-16um。Npc1~(+/+)組TCs細胞質中細胞器十分豐富,如微絲、高爾基體、線粒體、微管、中間絲等結構,而Npc1~(-/-)組TCs細胞質中的細胞器比例低于Npc1~(+/+)組。7.普通顯微鏡下和SEM掃描結果顯示Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)組TCs的細胞結構主要由胞體和突起(Telopodes,Tps)構成。細胞的胞體較小,細胞核根據(jù)Tps的數(shù)量呈梭形、星形或紡錘形。TCs細胞膜表面凹凸不平,兩組之間的形態(tài)學無差異。8.油紅O染色、茜素紅染色和細胞免疫熒光對誘導后的肝臟TCs進行鑒定結果顯示:Npc1~(-/-)組TCs誘導后的陽性率均顯著低于Npc1~(+/+)組。結論Npc1基因突變導致肝臟組織形態(tài)發(fā)生改變,大量巨噬細胞聚集引發(fā)炎癥反應,而炎癥反應的發(fā)生可能是引起肝臟細胞凋亡和肝功能受損的重要原因之一;隨后研究發(fā)現(xiàn)肝臟TCs在誘導條件下可向成脂、成骨、成心肌樣細胞分化;而Npc1基因突變對肝臟中TCs的多向分化潛能具有抑制作用。
【圖文】：

圖1 NPC1小鼠基因型鑒定結果雜合型：Npc1+/-；突變型：Npc1-/-。W：野生型引物；M：突變型引物 results of NPC1 mice+; Heterozygote: Npc1+/-; Mutant: Npc1-/-; W: Wild type primers; M: Muta圖2. P60 Npc1+/+和 Npc1-/-小鼠體重、肝臟重量及肝功能的比較分析

附圖圖1 NPC1小鼠基因型鑒定結果野生型：Npc1+/+；雜合型：Npc1+/-；突變型：Npc1-/-。W：野生型引物；M：突變型引物；Marker：分子量標準Fig.1 Genotyping results of NPC1 miceWild type: Npc1+/+; Heterozygote: Npc1+/-; Mutant: Npc1-/-; W: Wild type primers; M: Mutant primers.
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R725.8

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7 周，

本文編號：2594008