【摘要】：背景:先天性巨結腸又稱希爾施普龍病(Hirschsprung’s disease,HSCR),是丹麥醫(yī)生Hirschsprung于1886年首次描述。發(fā)病率約1/5000活產新生兒,HSCR的病因是的遠端腸壁內無神經節(jié)細胞,其病理生理機制是由于腸神經系統(tǒng)(ENS)缺失,而沒有神經介導的推進運動模式,導致遠端腸段處于痙攣狹窄狀態(tài),近端結腸蓄便、積氣繼發(fā)擴張和肥厚漸漸造成了巨結腸病變。HSCR的主要癥狀包括便秘,嘔吐,腹脹和生長障礙。未經治療的患兒,通常會因為在腸道炎癥(小腸結腸炎)或腸穿孔的情況下,血流細菌感染發(fā)生兒童時期死亡。目前HSCR的發(fā)病機制尚未完全明了,但已發(fā)現的與先天性巨結腸發(fā)病密切相關的易感基因有十多種,如RET、GDNF、ECE1、EDN3、NRTN、SOX10、PHOX2B、NRG1等。除基因組學外,考慮腸道微環(huán)境變化對ENS的發(fā)育有影響。腸道菌群是目前研究的新熱點,其不僅是體內最復雜、最重要的微生物動態(tài)系統(tǒng),還與機體以及外部環(huán)境之間保持動態(tài)平衡關系起到至關重要的作用。穩(wěn)定的菌群環(huán)境有利于嬰幼兒的生長發(fā)育和免疫系統(tǒng)建立。腸道中有著約1000種細菌,總數為1 X10~(14)個,厚壁細菌和擬桿菌是腸道菌群中的主要細菌,約占腸道菌群總數的90%。這些定居在腸道的微生物與人體相互依存共生,它們與宿主之間和平共處,彼此間相互依賴且相互制約。目前有文獻證明先天性巨結腸患者的雙歧桿菌和乳酸菌低于正常人,擬桿菌及厚壁變形菌多于正常人。先天性巨結腸的發(fā)生是由于多個基因突變和腸道微環(huán)境紊亂等因素共同作用的復雜過程。是否存在腸道菌群改變或者代謝產物異常,而可能在先天性巨結腸發(fā)病的作用,只有解決以上問題,為深入認識該病提供理論依據。代謝組學技術是一門新興的、對生物體液和糞便等排泄物進行檢測及分析的方法,其通過遺傳修飾或生理刺激的代謝產物的變化來研究生物體系的代謝途徑。該技術通過在先天性巨結腸中找到關鍵代謝物及相關代謝通路,進一步探討先天性巨結腸的病因機制。目的:本研究通過腸道菌群及代謝組學分析,探討先天性巨結腸患者的腸道菌群及代謝通路差異,以期找到與發(fā)病存在相關的信號通路,為HSCR的綜合診斷治療開展了新方向。方法:(1)選取2018年4月至2018年12月在天津市兒童醫(yī)院新生兒外科治療的先天性巨結腸患兒13例及其母親9例糞便與對照正常兒及其母親組4例(無消化系統(tǒng)疾病以及1個月內未使用抗生素的患兒及其母親)�；颊呷脒x的標準:先天性巨結腸患兒經過病理學檢查確診,糞便收集前30日內未使用糖皮質激素和任何抗生素;其母親無飲酒不良嗜好;年齡介于0-15歲之間,男女性別比保持均衡。排除標準:近一月有急性腹瀉病史的患兒或者有慢性腹瀉史。將入選患者及其母親分別記為組1(group1,n=13),組2(group2,n=9)。對照組選擇無消化系統(tǒng)疾病以及1個月內未使用抗生素的患兒及其母親。對照組的兒童及母親分別記為組3(group3,n=4),組4(group4,n=4)。收集研究對象的臨床資料、血漿標本和糞便標本。提取糞便DNA,并對16S rDNA的V4-V5高變區(qū)進行PCR擴增。采用高通量測序法,并對測序回來的數據進行分析,并通過構建物種進化樹、Alpha多樣性、Beta多樣性和LEfSE分析先天性患兒腸道的菌群分布結構,多樣性及豐度分析,采用PICRUSt軟件進行16S功能預測分析,找到差異通路,差異蛋白和RNA。(2)用液相色譜儀-質譜儀(LC-MS)對收集的研究對象進行檢測全譜代謝組檢測,找到差異代謝物,分析與之相關的代謝通路,進一步揭示可能存在的調控作用及機制。結果:1.從整體菌群分布看,發(fā)現兩組樣本菌群在總水平上的豐富度及種類差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。2.KEGG功能預測結果顯示在lever2水平,HSCR患兒的內分泌系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、次生代謝物產物系統(tǒng)和細胞轉化遷移的表達低,系統(tǒng)調控能力差,易發(fā)生紊亂失調。在lever3水平,PPAR信號通路、脂肪細胞因子通路、糖磷脂生物合成、鞘脂(神經脂質)代謝、亞油酸代謝、次級膽汁酸生物合成、初級膽汁酸生物合成、類NOD受體信號通路、孕酮-介導的卵母細胞成熟和類黃酮生物合成的含量低,提示HSCR患兒的脂代謝合成障礙,這可能與HSCR發(fā)病機制呈負相關。HSCR母親組與正常母親組相比,并無明顯差異,則遺傳關聯性小。3.COG功能預測結果顯示COG1183、COG1640和COG0464等蛋白質的低表達,證明了HSCR患兒的脂代謝、碳水化合物代謝和細胞信號轉導障礙參與HSCR發(fā)病。4.對比分析HSCR患兒與正常對照組的全代謝譜特征,結果發(fā)現HSCR患兒亞油酸代謝、膽汁分泌、鞘脂類代謝、腫瘤中的膽堿代謝、磷脂酶D信號通路、脂肪消化吸收和PPAR信號通路有明顯差異,神經鞘氨醇、乳糖苷、鞘磷脂、鞘氨醇磷酸膽堿、膽固醇酯、膽固醇、膽汁化合物、卵磷脂、前列腺素α2、磷脂酰膽堿、脂肪酸、磷脂(C00865)、9,10-二羥基十八碳-12-烯酸和9,10,13-三羥基辛基-11-烯酸下調;L-谷氨酸、磷脂(C00416)、溶血磷脂酰膽堿、四乙基、9S-羥基十八碳二烯酸及13S-羥基十八碳二烯酸上調。HSCR的致病機制與脂質代謝存在關聯可能性。結論:基于高通量測序及代謝組學分析,HSCR患兒的脂代謝、碳水化合物代謝和細胞信號傳導的障礙,可能阻礙腸神經系統(tǒng)發(fā)育。另一方面兩部分研究都分析顯示患兒的PPAR信號通路差異。
【圖文】：

樣本中的細菌 16S rRNA 的 V4-V5 區(qū)進行生物學信息分析，探討先天性巨結腸患兒的腸道微生物的特征及優(yōu)勢菌群變化情況，從而為 HSCR 病因及分子機制研究、臨床診治及預防提供更加有力的理論依據。1.1 實驗對象和方法1.1.1 實驗對象（1）隨機選取 2018 年 4 月至 2018 年 12 月在天津市兒童醫(yī)院新生兒外科治療的先天性巨結腸患兒 13 例及其母親 9 例糞便與對照正常兒及其母親組 4 例（無消化系統(tǒng)疾病以及 1 個月內未使用抗生素的患兒及其母親）。HSCR 患兒組男 10 例女 3 例。年齡 39 時~36 月，平均 5.6±9.6 月。（2）患者入選的標準：先天性巨結腸患兒經過鋇餐灌腸檢查診斷巨結腸病變，直腸組織活檢（直腸黏膜或全層）：直腸結腸處未見典型神經節(jié)細胞確診。如圖 1-1 所示。年齡介于 0-15 歲之間，糞便收集前 30 日內未使用糖皮質激素和任何抗生素；其母親無飲酒不良嗜好；排除標準：近一月有急性腹瀉病史的患兒或者有慢性腹瀉史。

10圖 1-2 生物信息學分析流程圖樣本所包含的 OTU 的總數，，觀察隨樣U 是指核心 OTU，是所有樣本共有的TU 數目的減少情況。具有不同測序數量的樣本物種的多樣逐漸平坦，說明更多的取樣也只會產所有物種幾乎全覆蓋；反之說明樣品本量的需要。0 OTU 的序列繪制進化樹。系統(tǒng)發(fā)育排序物種親緣度，判斷差異物種歸屬樣本內物種多樣性，常用的指標有 C
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R722.1

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本文編號：2592711