【摘要】：目的：再生障礙性貧血（簡稱再障，AA）是兒童常見的難治性血液系統(tǒng)疾病之一，尤其是重型再生障礙性貧血（SAA），臟器出血和嚴(yán)重感染的發(fā)生率高。應(yīng)用抗胸腺細胞球蛋白/抗淋巴細胞球蛋白（ATG/ALG）聯(lián)合環(huán)孢素A（CsA）的強化免疫抑制治療（IST）方案的推出，使急性再障的早期病死率降低，長期存活率及生存質(zhì)量與造血干細胞移植（HSCT）相近。然而，無效、療效延遲出現(xiàn)、復(fù)發(fā)、日后轉(zhuǎn)變?yōu)镻NH、MDS和急性白血病等疾病的幾率較高和早期死亡仍是IST顯著存在的問題。這使得我們應(yīng)進一步探索再生障礙性貧血的完整病因以獲得更為有效的治療手段。 目前普遍認為免疫異常尤其是淋巴細胞免疫功能紊亂在再障的發(fā)病中起重要作用。除免疫功能異常外，其他機制如造血微環(huán)境缺陷及造血干細胞內(nèi)在增殖能力受損也有可能參與了再生障礙性貧血的發(fā)病過程，越來越多的證據(jù)表明造血微環(huán)境對造血過程必不可少[16-17]。 骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是構(gòu)成造血微環(huán)境的重要組成成分，骨髓中成骨細胞與脂肪細胞具有同源性，均來源于BMMSCs。紅髓脂肪化是再障最具特征性的病理改變之一。主要原因是再障患者骨髓中脂肪細胞明顯增多。然而到目前為止，再生障礙性貧血的發(fā)病是否與脂肪細胞過度生成或是間充質(zhì)干細胞功能缺陷有關(guān)尚未明確。是否BMMSCs的分化能力發(fā)生變化，導(dǎo)致其向成骨、成脂肪分化的平衡失調(diào)，從而骨髓中BMMSCs成脂增多，再障患兒出現(xiàn)骨髓脂肪化這一特征性病理改變？我們假設(shè)如果BMMSCs發(fā)生改變，使其向脂肪細胞的轉(zhuǎn)化增加，那么成骨細胞的生成則會減少，而基于成骨細胞龕在造血中的重要地位，在造血微環(huán)境中，BMMSCs及其分化成的細胞對造血的影響及相互關(guān)系目前的研究尚未明確。 本課題回顧性分析了我院小兒科重型再障（SAA）患兒應(yīng)用ATG聯(lián)合聯(lián)合CsA免疫抑制治療（IST）取得的臨床療效、不良反應(yīng)、治療前后外周血三系及T細胞亞群的變化情況，進一步探討了IST的患兒造血功能恢復(fù)的情況；同時完成SAA患兒BMMSCs的分離培養(yǎng)及純化，檢測AA患兒的BMMSCs在增殖、分化及凋亡等方面的變化，并檢測其可能的作用機制，此外，進一步探討B(tài)MMSCs的生物學(xué)特性改變對造血的影響，從另一個研究思路探討AA發(fā)病的機制。以指導(dǎo)臨床上對不同致病原因的患兒采取不同的治療方法。 方法： 1回顧性分析我院1996年6月-2010年11月收治的應(yīng)用ATG聯(lián)合CsA免疫抑制治療SAA和vSAA患兒24例。所有患兒均給予兔-ATG [4-5mg/（kg·ｄ）×5]，同時給予CsA口服，初始劑量3-5mg/（kg·d）。治療前清除感染灶，積極防治過敏反應(yīng)，密切觀察治療前后臨床表現(xiàn)的改善及血常規(guī)的恢復(fù)規(guī)律，以及用藥期間的不良反應(yīng)反射率等情況。 2分離培養(yǎng)擴增AA患兒的BMMSCs：以正常人作為對照組，觀察AA患兒BMMSCs的原代細胞培養(yǎng)及擴增傳代的特點。 3選取生長狀態(tài)良好的P3代細胞，瑞氏吉姆薩染色后固定，顯微鏡下比較AA患兒和正常人BMMSCs的形態(tài)差別。 4MTT法測定AA患兒BMMSCs生長曲線。 5加入分化誘導(dǎo)液對比AA患兒和正常人BMMSCs成脂分化能力的差異。 6RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法比較AA患兒與正常人BMMSCs成脂分化的標(biāo)志基因PPAR2基因水平及蛋白水平的表達情況，了解有無差異。 7建立BMMSCs與K562細胞的共培養(yǎng)體系，直接計數(shù)法和MTT法檢測BMMSCs對K562細胞增殖的影響。 8.Hoechest33342染色方法和應(yīng)用透射電鏡進一步觀察比較AA患兒與正常人BMMSCs的形態(tài)及結(jié)構(gòu)差異。 結(jié)果： 124例患兒免疫抑制治療的總有效率為66.7％，起效時間3-7個月。應(yīng)用ATG主要不良反應(yīng)為過敏、血清病和感染,發(fā)病率分別為83.3%、54.1%和70.8%，無被迫停藥病例。3例死亡,2例死于ATG治療后1個月內(nèi)發(fā)生的嚴(yán)重敗血癥，1例死于ATG治療后2個月發(fā)生的腦出血。療效相關(guān)統(tǒng)計分析顯示，從確診再障到接受ATG治療，病程≤6個月者有效率明顯高于病程＞6個月者，兩組總有效率分別為92.3%和50%（P0.05）；ATG治療后，淋巴細胞絕對值（ALC）下降幅度＞2×109/L者的有效率明顯高于下降幅度≤2×109/L者，兩組總有效率分別為92.3%和50%（P0.05）；患兒的性別、年齡、疾病嚴(yán)重程度、是否發(fā)生血清病以及T細胞亞群(CD4/CD8比值)均與療效無關(guān)。隨訪過程中未見PNH、MDS及急性白血病等克隆性疾病發(fā)生。 2AA患者骨髓中脂肪細胞增多，造血細胞明顯減少 3AA患兒BMMSCs生長緩慢，克隆形成較少，貼壁及融合時間更長。在傳代到P3代之后，細胞增殖能力增強，經(jīng)瑞吉染色，發(fā)現(xiàn)細胞細胞形態(tài)均一，呈纖維狀生長，旋渦狀排列，胞體較小，細胞核致密。AA患者與正常對照組BMMSCs在光鏡下的形態(tài)基本無差異。 4AA患者的BMMSCs的增殖能力遠弱于正常對照組。 5與正常對照相比，再障患兒BMMSCs體外培養(yǎng)具有更強的易成脂性（78.6%±4.1%vs0%）（P0.001）。 6.再障患兒的脂肪細胞生成調(diào)控因子PPARγ2的mRNA表達水平（3.13±0.02）顯著高于正常對照組（2.80±0.31），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.025）；蛋白水平一致。 7BMMSCs對K562細胞增殖的影響： 為了探討B(tài)MMSCs分化異常對細胞增殖的影響，我們選取未出現(xiàn)明顯脂肪細胞分化的生長狀態(tài)良好的BMMSCs，經(jīng)含成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)后油紅O證實細胞轉(zhuǎn)化為脂肪細胞，建立支持細胞模型。加入K562細胞共培養(yǎng)，，經(jīng)MTT檢測，結(jié)果顯示，K562細胞在脂肪誘導(dǎo)分化劑培養(yǎng)的BMMSCs上的生長速度（0.651±0.06）明顯低于在正常MSC上的增殖速度（0.879±0.03）,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.001），兩組K562細胞的生長速度均高于正常對照（0.533±0.05, P0.001）。 8.Hoschest染色結(jié)果顯示正常對照組與觀察組均未發(fā)現(xiàn)有明顯凋亡現(xiàn)象。 9經(jīng)電子顯微鏡觀察，再障患者和正常對照組之間相比，核內(nèi)部結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別，但從胞漿成分看，在正常對照組中核周及細胞膜之間充斥著大量線粒體及囊泡樣結(jié)構(gòu)，聚集成片，而在再障患者細胞中，其數(shù)量相對較少。 結(jié)論： 1ATG聯(lián)合CsA的免疫抑制治療是兒童SAA和vSAA的有效療法，再障的病程及治療過程中ALC的下降程度可能與免疫抑制治療的療效有關(guān)，治療過程中需積極預(yù)防和控制ATG不良反應(yīng)，避免治療相關(guān)死亡。 2第二部分的研究我們發(fā)現(xiàn)再障患者的骨髓基質(zhì)干細胞在脂肪細胞能力方面明顯增強。隨后的研究發(fā)現(xiàn)患者基質(zhì)干細胞中PPAR-gamma的表達明顯增強，無論在基因水平還是蛋白水平都得到了驗證。從而提示再障患者骨髓的基質(zhì)干細胞在脂肪轉(zhuǎn)化能力增強是基因表達變化所致。進而在一定程度上解釋了再障患者骨髓脂肪化的原因。 3BMMSCs細胞向脂肪細胞分化后，作為滋養(yǎng)細胞，對上層細胞的支持能力明顯下降，提示骨髓脂肪化會降低對干細胞的支持功能。從核酸染色及電鏡結(jié)果看，這種支持功能的下降，有可能和患者基質(zhì)細胞胞漿細胞器的變化影響了細胞的功能狀態(tài)，導(dǎo)致細胞因子分泌發(fā)生變化有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R725.5

【參考文獻】

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本文編號：2549251