【摘要】：第一部分靶向增強(qiáng)、干擾人軟骨細(xì)胞SEDL基因，，基因芯片檢測細(xì)胞內(nèi)骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)變化 目的：靶向增強(qiáng)或者干擾人軟骨細(xì)胞SEDL基因，骨再生PCR芯片檢測細(xì)胞內(nèi)骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究SEDT發(fā)病機(jī)制提供高通量信息。 方法：采用定向克隆及大腸桿菌內(nèi)同源重組的方法分別構(gòu)建靶向增強(qiáng)SEDL的腺病毒質(zhì)粒pAd5-SEDL和靶向干擾SEDL的慢病毒質(zhì)粒LV-siSEDL，分別導(dǎo)入293T細(xì)胞包裝成重組腺病毒pAd5-SEDL和重組慢病毒LV-siSEDL，酶切鑒定（課題組前期已完成）。HEK293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒，收集病毒液，檢測病毒滴度。將重組腺病毒、重組慢病毒以最適感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）分別感染HC-a，實驗分4組：增強(qiáng)組（HC-a/pAd5-SEDL）、增強(qiáng)陰性對照組（HC-a/pAd5空載體）、干擾組(HC-a/LV-siSEDL)、干擾組陰性對照組（HC-a/LV空載體），收集4組細(xì)胞mRNA進(jìn)行骨再生PCR芯片檢測。 結(jié)果：1、收獲高滴度重組腺病毒pAd5-SEDL，病毒滴度為2.6×1011pfu/ml。 2、重組腺病毒和重組慢病毒成功感染HC-a，重組腺病毒對HC-a的MOI值為50，重組慢病毒對HC-a的MOI值為20。 3、基因芯片結(jié)果：SEDL基因表達(dá)改變導(dǎo)致其上下游基因表達(dá)發(fā)生變化，其中與軟骨生長發(fā)育密切相關(guān)的基因有：COL2A、CD36、FLT1、GDF10、IGF1等。 結(jié)論：SEDL基因與骨發(fā)育相關(guān)，軟骨細(xì)胞內(nèi)SEDL基因表達(dá)變化引起細(xì)胞內(nèi)與骨發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)改變，如COL2A等。 第二部分Sedlin蛋白對人軟骨細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制初步研究 目的:結(jié)合基因芯片篩選出來的差異基因，探索Sedlin蛋白對人軟骨細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制，進(jìn)一步探索X-連鎖遲發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良的發(fā)病機(jī)制。 方法:實驗分為增強(qiáng)組（感染pAd5-SEDL的HC-a）、干擾組（感染LV-SEDLsi的HC-a）、空白對照組（HC-a）。應(yīng)用MTT法檢測三組HC-a的增殖活性；QPCR檢測三組HC-a中SEDL基因和COL2A基因mRNA表達(dá)；Western blot檢測三組HC-a中sedlin蛋白表達(dá)；細(xì)胞免疫組化檢測三組HC-a Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。 結(jié)果:1、與空白對照組相比，增強(qiáng)組HC-a細(xì)胞增殖活性增高，干擾組細(xì)胞增殖受到明顯抑制（P0.05）。 2、QPCR結(jié)果顯示增強(qiáng)組HC-a SEDL基因表達(dá)量最高，空白對照組其次，干擾組HC-a表達(dá)量明顯降低（P0.001）。三組細(xì)胞COL2AmRNA表達(dá)量中，增強(qiáng)組明顯高于空白對照組和干擾組，干擾組表達(dá)量最低（P0.001）。 3、三組HC-a中，增強(qiáng)組sedlin蛋白表達(dá)最高，其次為空白對照組，干擾組表達(dá)量最低（P0.001）。 4、免疫組化結(jié)果顯示三組HC-a中，增強(qiáng)組Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)量最高，空白對照組其次，干擾組HC-a內(nèi)幾乎不表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白（P0.001）。 結(jié)論:SEDL通過調(diào)節(jié)Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)影響人軟骨細(xì)胞增殖。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R726.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2537774