發(fā)布時(shí)間：2019-08-19 08:35

【摘要】：研究背景出生缺陷(birth defects,BD)是指由于遺傳或環(huán)境的因素影響了胚胎或胎兒的正常發(fā)育,出生后表現(xiàn)出的身體結(jié)構(gòu)的缺陷或功能障礙,往往造成患兒的致病、致殘、致畸或致死。近幾十年來,隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步,全社會(huì)生育醫(yī)療保健水平和衛(wèi)生狀況有了很大的提高,相對(duì)于其他致死因素,出生缺陷已成為嬰幼兒死亡的主要原因。我國(guó)每年的出生人口總數(shù)為1000多萬,其中4%~6%的嬰幼兒患有出生缺陷。出生缺陷已嚴(yán)重影響到我國(guó)出生人口的質(zhì)量,已成為我國(guó)重大公共衛(wèi)生問題。遺傳和環(huán)境因素的作用是導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生的主要原因。一般認(rèn)為,出生缺陷中20%~30%是由單純遺傳因素導(dǎo)致的,5%~10%是由單純環(huán)境因素造成的,而60%~70%則是由遺傳和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果。因此,遺傳因素以很大的比例影響出生缺陷的發(fā)生。在人類自身研究出生缺陷疾病受到倫理,研究周期長(zhǎng)等很多方面因素的制約,目前大部分出生缺陷發(fā)生的分子遺傳機(jī)理及作用機(jī)制仍不清楚。因此,動(dòng)物模型仍是研究各種出生缺陷發(fā)生機(jī)制的有效材料。乙烷亞硝甚脲(ethylnitrosourea,ENU)是一種強(qiáng)有力的化學(xué)誘變劑,主要誘發(fā)單堿基發(fā)生突變,通過對(duì)動(dòng)物進(jìn)行ENU誘變篩選可以獲得很多由基因突變導(dǎo)致的疾病表型,從而為人類醫(yī)學(xué)研究提供相應(yīng)的遺傳性疾病動(dòng)物模型。研究表明,ENU對(duì)小鼠的突變效率高達(dá)0.2%,而且這種突變是隨機(jī)的,不具有任何的傾向性,與以基因敲除為代表的典型的基因驅(qū)動(dòng)法相比,規(guī)模更大、速度更快、挖掘基因的力度更高。采用這種高效的隨機(jī)誘變方法對(duì)生長(zhǎng)周期短的多胎動(dòng)物進(jìn)行誘變,有望在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量可觀的突變個(gè)體,我們可以通過表型篩選以獲得我們感興趣的突變類型。ENU人工誘變已經(jīng)在果蠅、斑馬魚、小鼠等動(dòng)物中被證明是一種發(fā)現(xiàn)新的功能基因的有效方法,但在大動(dòng)物上進(jìn)行人工誘變以創(chuàng)造新的基因資源在國(guó)際上仍屬空白。豬的基因組相比小鼠基因組更接近于人類,通過人工誘變我們可以尋找到一些在小鼠中難以發(fā)現(xiàn)的人類遺傳性疾病相關(guān)的基因。建立巴馬香豬enu誘變篩選突變表型的技術(shù)體系;通過表型鑒定重點(diǎn)篩查出生缺陷表型并建立穩(wěn)定遺傳的家系,為研究相應(yīng)的人類出生缺陷疾病的作用機(jī)制提供穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型及相關(guān)材料。材料與方法1.巴馬香豬enu誘變挑選4-12月齡成年健康巴馬公豬81頭,按不同的enu劑量分為7組:45mg/kg組,4頭;65mg/kg組,9頭;75mg/kg,11頭;85mg/kg,35頭;90mg/kg,11頭;95mg/kg,7頭;105mg/kg,4頭。enu采用耳靜脈滴注,每頭公豬按相應(yīng)劑量共注射3次,每周一次,連續(xù)三周。注射誘變劑后每隔1周人工采集公豬精液監(jiān)測(cè)其精液品質(zhì),待精液活力恢復(fù)至30%以上,誘變公豬作為f0代與野生型母豬配種,產(chǎn)生f1代個(gè)體。從誘變f0公豬中挑選了兩個(gè)誘變家系(包括f0父母和5頭f1后代,家系ienu注射量為65mg/kg,家系iienu注射量為85mg/kg),采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序法(restrictionsiteassociateddnasequencing,rad-seq)對(duì)其enu引入的突變及其頻率進(jìn)行分析和評(píng)估。對(duì)出生的f1代進(jìn)行表型鑒定,重點(diǎn)篩查出生缺陷突變表型。對(duì)存活至成年的突變f1代公豬(或母豬),以野生型母豬(或公豬)與之交配,對(duì)其出生的f2代進(jìn)行表型鑒定,若出現(xiàn)與f1代突變表型相同的性狀,進(jìn)一步按顯性家系建系擴(kuò)繁;若突變表型在f2代未能遺傳,則按隱性家系建立方案進(jìn)行建系工作。同時(shí)選留一定數(shù)量無突變表型的f1公豬直接建立隱性家系:f1公豬與野生型母豬交配后在其f2代中選留4頭以上母豬再與f1公豬回交,對(duì)出生的f3代進(jìn)行表型鑒定重點(diǎn)篩選出生缺陷突變表型。2.巴馬香豬enu誘變獲得腹股溝疝伴發(fā)先心病模型家系的建立與研究對(duì)獲得的突變家系進(jìn)行詳細(xì)準(zhǔn)確的表型鑒定:對(duì)腹股溝疝表型進(jìn)行多次外觀鑒定,并結(jié)合手術(shù)解剖加以確認(rèn);詳細(xì)記錄患病豬只腹股溝疝發(fā)生的部位、大小、類型及其并發(fā)癥。結(jié)合家系系譜圖,按患病個(gè)體發(fā)生的比例分析該家系腹股溝疝可能的遺傳模式。以illumiina60k豬snp芯片對(duì)該家系豬只進(jìn)行全基因組掃描分析,確定腹股溝疝可能的易感位點(diǎn),通過生物信息學(xué)方法查找分析易感位點(diǎn)附近的基因,設(shè)定易感候選基因后進(jìn)行外顯子測(cè)序。對(duì)家系內(nèi)所有f3代豬進(jìn)行血液生理生化指標(biāo)檢測(cè),心電圖、b超等臨床特征檢查以獲得與腹股溝疝發(fā)病相關(guān)的詳細(xì)的臨床基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。對(duì)患豬手術(shù)過程中切取的疝環(huán)組織及疝囊組織作病理切片及免疫組化分析。結(jié)合心電圖、b超及心臟解剖判定結(jié)果,統(tǒng)計(jì)分析該家系腹股溝疝與先心病發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。3.巴馬香豬enu誘變獲得白化合并生長(zhǎng)遲緩及后肢癱瘓復(fù)合疾病家系的建立與研究目的研究分別對(duì)白化、生長(zhǎng)遲緩及后肢癱瘓疾病表型進(jìn)行遺傳學(xué)分析,通過候選基因外顯子直接測(cè)序的方法對(duì)家系成員分別進(jìn)行白化、生長(zhǎng)遲緩及后肢癱瘓相關(guān)致病基因進(jìn)行突變檢測(cè)分析。結(jié)果1.巴馬香豬enu誘變1.1誘變公豬恢復(fù)及配種繁殖情況:enu誘變處理后,公豬無精期時(shí)間隨劑量升高而增加,但不完全一致,存在個(gè)體差異;精液質(zhì)量恢復(fù)率(精子活率恢復(fù)至70%以上,密度107個(gè)/ml)隨劑量升高而增加,但不完全一致,存在個(gè)體差異,高劑量個(gè)體部分無法恢復(fù)生育能力;誘變恢復(fù)后的公豬各劑量組間繁殖性能(返情率、妊娠率、平均窩產(chǎn)仔數(shù))無明顯差異,原因可能受季節(jié)、受配母豬、統(tǒng)計(jì)誤差等多種因素的影響。1.2f1代enu引入突變分析:f1代enu引入突變的平均頻率在65mg/kg和85mg/kg劑量分別為1.63×10-6和5.86×10-6;突變類型主要為g-a類型的突變,且總體上轉(zhuǎn)換類型的突變占71.2%;突變分布符合基因組組成比例,即大量的enu引入的突變分布在intergenic區(qū)域(基因間區(qū))和內(nèi)含子區(qū)域,編碼區(qū)由于在基因組中所占比例較少,因此誘變產(chǎn)生的突變相應(yīng)地較少。1.3誘變家系組建及突變體篩選:f1代篩選到突變體126個(gè),出生缺陷包括腳趾畸形、短尾、腹壁缺損、彎尾、四肢發(fā)育異常、顱骨發(fā)育不全、腦膨出、歪鼻等,其中大部分為致死性。我們對(duì)其中51頭存活至成年的突變個(gè)體進(jìn)行了建系驗(yàn)證其遺傳性,除2頭白化個(gè)體遺傳外,其余均無遺傳。在已完成建系的11個(gè)隱性家系中發(fā)現(xiàn)7個(gè)家系具有突變表型,其中6個(gè)家系均表現(xiàn)為腹股溝疝,另1個(gè)家系為毛色白化合并生長(zhǎng)遲緩表型。2.巴馬香豬enu誘變獲得腹股溝疝模型家系的建立與研究2.1腹股溝疝遺傳模式分析:獲得的腹股溝疝大家系其腹股溝疝為限性性狀,f3代發(fā)病率為65%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單基因隱性遺傳理論百分比的25%,其遺傳模式較為復(fù)雜,目前無法明確,有待進(jìn)一步研究。2.2illumiina60k豬snp芯片全基因組掃描發(fā)現(xiàn)在第10號(hào)染色體第10138848bp處有一個(gè)強(qiáng)的信號(hào)位點(diǎn)(p=0.00022)。2.3以spata17為候選基因進(jìn)行的外顯子測(cè)序,未找到與腹股溝疝表型相符合的突變。2.4病理切片顯示腹股溝疝患豬腹環(huán)周圍肌肉組織出現(xiàn)肌肉萎縮,肌纖維組織間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),血管淤血,神經(jīng)纖維變性,肌肉組織間脂肪組織營(yíng)養(yǎng)不良等病理變化;透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)患病豬只疝囊組織中膠原纖維出現(xiàn)變性、萎縮、斷裂及降解等病變;免疫組化分析發(fā)現(xiàn)患病豬只疝囊組織中Ⅰ型膠原含量及Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原含量的比例均低于正常豬對(duì)應(yīng)部位腹橫筋膜中的含量(p0.05),而Ⅲ型膠原含量則高于正常豬(p0.05),Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量總和在兩組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。2.5先心病發(fā)病率在f3代疝氣豬中高達(dá)20.6%,在總的公豬中為13.5%,非疝氣公豬中未檢測(cè)出先心病;盡管母豬不患疝氣,但先心病患病率為16.3%,與家系f3代群體總發(fā)病率(14.9%)及f3代總體公豬中先心病患病率接近。3.巴馬香豬enu誘變獲得白化合并生長(zhǎng)遲緩及后肢癱瘓復(fù)合疾病表型家系的建立與研究3.1針對(duì)f3代白化表型進(jìn)行的mc1r候選基因外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變個(gè)體在該基因第894位堿基處插入了cc兩個(gè)堿基。3.2針對(duì)生長(zhǎng)遲緩性狀進(jìn)行的mc3r及mc4r候選基因外顯子測(cè)序未發(fā)現(xiàn)與表型相符合的突變。3.3針對(duì)f4代后肢癱瘓表型進(jìn)行的smn1候選基因外顯子測(cè)序未發(fā)現(xiàn)該基因有突變。結(jié)論1本課題首次在大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物巴馬香豬上成功建立了enu誘變體系,探索并確定了小型豬enu誘變合適的劑量和方法,證實(shí)了enu誘變體系在小型豬上應(yīng)用的可行性。2本研究獲得了大量出生缺陷突變表型,但大部分未能遺傳,原因可能是大多數(shù)出生缺陷為致死性或?yàn)槎嗷蜻z傳控制。3通過巴馬香豬enu誘變建立了能穩(wěn)定遺傳的腹股溝疝伴發(fā)先心病的大動(dòng)物模型家系,研究表明腹股溝疝與先心病存在很大的相關(guān)性,其發(fā)病機(jī)制可能與膠原代謝異常有關(guān);盡管其遺傳模式仍不明確,確切的分子遺傳機(jī)制也需進(jìn)一步研究,但該家系的獲得和建立可為人腹股溝疝病理機(jī)制及先心病的研究提供穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型和研究材料。4獲得并建立了白化合并生長(zhǎng)遲緩及后肢癱瘓復(fù)合疾病家系。其中白化性狀為mc1r基因第894堿基處插入cc兩個(gè)堿基引發(fā)的突變導(dǎo)致。該插入突變并不符合enu誘變以單堿基顛換或轉(zhuǎn)換為主的單堿基點(diǎn)突變類型,提示研究納入的巴馬香豬群體本身就可能攜帶MC1R基因的隱性突變。同時(shí),通過查閱文獻(xiàn)表明,我們?cè)谶@一隱性白化巴馬香豬發(fā)現(xiàn)的MC1R基因的插入突變?yōu)樨iMC1R基因的一個(gè)新突變。生長(zhǎng)遲緩性狀及后肢癱瘓性狀尚未鑒定到致病基因,加上F1代突變公豬的腳趾畸形性狀并未能遺傳,提示ENU誘變可能在該家系基因組上誘發(fā)了多位點(diǎn)的單堿基突變。5綜上,巴馬香豬ENU誘變是獲得人類出生缺陷模型的有效手段,可為研究人類遺傳性出生缺陷疾病復(fù)雜的病理機(jī)制提供穩(wěn)定遺傳的模型家系和研究材料。
【圖文】：

圖 1-1 ENU 誘變引入突變頻率及模式分析。兩個(gè)家系用于突變頻率分析，其中家系 I ENU 注射量為 65mg/kg，，而家系 II ENU 注射mg/kg。通過 RAD 測(cè)序分析，檢測(cè)僅存在于 F1 后代基因中的突變，認(rèn)為此類突變應(yīng)為 EN。B，分析顯示 ENU 引入突變類型主要為 G-A 類型的突變，且總體上轉(zhuǎn)換類型的突變占 7C），此外突變分布符合基因組組成比例，即大量的 ENU 引入的突變分布在 intergenic 區(qū)域

F1中發(fā)現(xiàn)的多種突變體表型
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R725.9

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本文編號(hào)：2528127