【摘要】：第一部分單基因肥胖的分子遺傳學研究 在過去的十幾年中,肥胖人口的不斷增長已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)公共衛(wèi)生事業(yè)的主要挑戰(zhàn)。作為一種復(fù)雜疾病,肥胖的產(chǎn)生除了與環(huán)境有關(guān)外,還與遺傳因素關(guān)系密切。據(jù)估計遺傳因素對體重的影響可能達40-70%。由此可見,對肥胖產(chǎn)生分子機制的研究,具有十分重要的意義。鑒于肥胖成因的復(fù)雜性,對一些早發(fā)、極端、以單基因方式遺傳肥胖致病基因的研究成為了人們研究肥胖分子機制的突破口。目前人們已經(jīng)鑒定出20多種單基因肥胖的致病基因,但只能解釋不到5%的極端肥胖,對剩余肥胖分子機制的研究將是人們面臨的一個巨大挑戰(zhàn)。 人類生長是一個受到多種因素影響的復(fù)雜過程,其中遺傳因素在身高決定中占主要作用。一直以來,人們對于身材矮小的分子機制的研究較多,而對高大身材,特別是嬰幼兒及兒童期身材高大或過度生長的分子機制研究相對較少。兒童期身材高大或者過度生長可能由多種原因?qū)е?其中最常見的原因是肥胖和超重。因此,針對導致兒童期身材高大或過度生長、肥胖或超重的致病基因鑒定對于人們理解兒童生長和機體組成的機制具有十分重要的意義。 本研究中我們收集了1個常染色體顯性肥胖伴過度生長家系和4個早發(fā)肥胖核心家系。在獲得知情同意后,對這5個家系進行了分子遺傳學研究。 常染色體顯性肥胖伴過度生長家系患者除了肥胖外,兩位處于青春期的患者身高要明顯高于同齡人,因此我們該家系命名為肥胖伴過度生長家系。我們首先在先證者中篩查了的23個基因,包括已報道的導致非綜合征型單基因肥胖的致病基因和一些在轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)與體重調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。在排除這些基因的改變之后,我們使用Affymetrix SNP6.0芯片對部分家系成員分兩批進行拷貝數(shù)分析和全基因組連鎖分析,在12號染色體長臂和短臂各發(fā)現(xiàn)一段LOD值為2.4的區(qū)域。其中短臂區(qū)域位于rs10491968至rs11063753,長度為1,975,647bp；長臂區(qū)域位于rs17105259至rs10160961之間,長度2,119,818bp。在得到連鎖結(jié)果后,我們在連鎖區(qū)域附近選擇微衛(wèi)星標記進行驗證和精細定位,將短臂的連鎖區(qū)域定位于D12S1050和D12S374之間,長度為2,299,067bp,長臂的連鎖區(qū)域定位于D12S313與12q/TG之間,長度為1,391,386bp。同時分別在短臂標記D12S1685與長臂標記12q/TTAT,當0=0時,獲得了最大LOD值2.68。 在進行全基因組連鎖分析的同時,我們對該家系的先證者進行了全外顯子組測序。結(jié)合全基因組連鎖分析和外顯子組測序結(jié)果,我們在位于12號染色體短臂的EFCAB4B基因中發(fā)現(xiàn)了1個在家系患者中共分離的錯義突變(p.R466W)。隨后我們在319例無關(guān)人群中對該變異進行了驗證。經(jīng)驗證我們發(fā)現(xiàn)兩例無關(guān)個體(一個超重,一個體重正常)存在與家系內(nèi)患者相同的改變,因此暫不能確定我們所發(fā)現(xiàn)的變異是否是導致家系肥胖表型的分子基礎(chǔ)。 針對4個早發(fā)肥胖家系,我們根據(jù)家系內(nèi)先證者的臨床表現(xiàn),首先其中兩個家系先證者進行MC4R、LEP和LEPR基因突變檢測。在家系2先證者中發(fā)現(xiàn)LEP基因一個純合的無義突變(c.163CT,p.Q55X),該突變?yōu)閲H首報,其父母為該突變的攜帶者。為了驗證其父母所攜帶的突變是否來自同一祖先,我們選擇LEP基因上下游各2Mb的微衛(wèi)星標記對該家系進行連鎖分析,從而確定了其父母所攜帶的突變來自于同一祖先。同時,我們在家系3先證者中發(fā)現(xiàn)MC4R基因一個純合無義突變,其父母和子女為該突變的攜帶者。 對于另外兩個家系的先證者,我們則對已報道的導致單基因肥胖的致病基因和一些在轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)與體重調(diào)節(jié)相關(guān)的23個基因進行了突變檢測。結(jié)果并沒有在這些基因中發(fā)現(xiàn)致病改變,但卻分別在兩個家系先證者中發(fā)現(xiàn)LEPR和SIMl基因的幾個與體重調(diào)節(jié)相關(guān)的SNP位點。 總之,在本研究中,我們使用全基因組連鎖分析和外顯子組測序等方法,在一個常染色體顯性肥胖伴過度生長家系中發(fā)現(xiàn)了一個與患者共分離的罕見變異,盡管該變異的致病性還需要進一步的確定,本文為肥胖這種復(fù)雜疾病分子機制的研究提供了新的思路。在兩個早發(fā)肥胖家系中分別發(fā)現(xiàn)了LEP、MC4R基因的純合無義突變,這是導致這兩個家系患者肥胖表型的分子基礎(chǔ)。其中LEP基因突變?yōu)橹袊巳褐惺状螆蟮馈?第二部分三種皮膚遺傳病的致病突變研究 皮膚病是指皮膚(包括皮膚附屬器官毛發(fā)、指甲、汗腺等)受到內(nèi)外因素的影響后,其形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生的病理改變。皮膚病的主要病因包括感染、過敏和遺傳因素影響。因遺傳物質(zhì)改變所引起的皮膚病稱為遺傳性皮膚病,有約300種單基因遺傳性皮膚病。本文對三種單基因遺傳性皮膚病(Bazex-Dupre-Christol綜合征、X連鎖無汗型外胚層發(fā)育不良和先天性無痛伴無汗)進行了致病基因突變研究,尋找或鑒定三種遺傳性皮膚病的致病基因改變。 Bazex-Dupre-Christol綜合征(Bazex-Dupre-Christol syndrome, BDCS)(MIM301845)是一種罕見遺傳性皮膚病,1964年由Bazex等人首先報道。BDCS的患者通常表現(xiàn)出廣泛的皮膚癥狀,最為常見的臨床表現(xiàn)為少毛、毛囊性皮膚萎縮和早發(fā)的基底細胞癌的三聯(lián)征。除此之外,在一些病人中還會出現(xiàn)粟丘疹、少汗、顱面部色素沉著,毛發(fā)上皮瘤,毛干異常等表型。BDCS呈X連鎖顯性遺傳方式遺傳,其致病區(qū)域在2011年被定位于Xq25-q27.1區(qū)域11.4Mb的范圍內(nèi),但迄今尚未發(fā)現(xiàn)致病突變。本研究中我們收集了來自歐洲的兩個BDCS家系,采用全外顯子組測序技術(shù)及Affymetrix SNP6.0技術(shù)平臺對家系樣品進行分析,以求能夠?qū)ふ业紹DCS的致病改變。在得到外顯子組測序結(jié)果后,我們首先對連鎖區(qū)域內(nèi)可疑改變進行Sanger測序驗證,但并沒有得到與疾病共分離的可疑改變。隨后我們對原始bam文件進行分析,對連鎖區(qū)域內(nèi)外顯子組測序reads覆蓋率較低或未覆蓋區(qū)域,以及在連鎖區(qū)域中未出現(xiàn)在bam文件中的基因進行補測,結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)可疑致病改變。通過使用Affymetrix SNP6.0技術(shù)平臺對家系成員進行拷貝數(shù)分析,發(fā)現(xiàn)兩個家系的患者都在Xq26.1-q26.2之間存在拷貝數(shù)增加,但該重復(fù)與DGV數(shù)據(jù)庫的已知CNV存在重疊,該拷貝數(shù)改變是否致病還需要進一步的分析驗證。 外胚層發(fā)育不良(Ectodermal Dysplasia, ED)是一類以牙齒、毛發(fā)、指甲等外胚層來源組織發(fā)育不良為特征的遺傳性綜合征的總稱。在這些綜合征中,最為常見的是X連鎖隱性少汗型外胚層發(fā)育不良(X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia, XLHED, MIM305100)。XLHED男性患者的臨床表現(xiàn)為無汗或少汗毛發(fā)稀疏或細黃、少牙或牙齒發(fā)育異常的三聯(lián)征。攜帶者女性由于X染色體的隨機失活會有不同程度的臨床表現(xiàn),另有30%左右的攜帶者不會表現(xiàn)出任何臨床癥狀。XLHED的致病基因為EDA,定位于Xq12.2-q13.1。到目前為止,HGMD上共記錄了大約180種EDA基因的突變。其中98%以上的突變導致XLHED,另有約2%突變會引起另一種X連鎖疾�。篨連鎖顯性牙發(fā)育不良(X-linked dominant hypodontia, MIM300606)。本研究中我們收集了6個XLHED家系,對家系內(nèi)患者EDA基因各外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界處進行PCR擴增后直接測序。我們在6個家系中鑒定出6個致病突變,5個為點突變,1個缺失突變。其中1個點突變(p.Q358L)和缺失突變?yōu)槭状螆蟮赖男峦蛔�。采用PCR產(chǎn)物酶切的方法,對p.Q358L進行了驗證。為了驗證所發(fā)現(xiàn)的缺失突變,通過使用定量PCR以檢測先證者和其家系成員的相對拷貝數(shù)。為了確定先證者的缺失范圍,我們在EDA基因第7、8外顯子之間以及EDA基因3'UTR末端和其下游2.5kb、5kb、7.5kb范圍內(nèi)分別設(shè)計引物進行PCR擴增,從而將缺失范圍初步確定為第8外顯子上游至EDA基因下游5kb。結(jié)合GAP-PCR擴增,最終將家系6先證者X染色體的缺失范圍確定為10,297bp,同時發(fā)現(xiàn)此缺失突變還導致位于EDA基因下游的AWAT2最后4個外顯子的缺失。另外,通過采用PCR直接測序和單體型分析的方法,我們對一個家系中的攜帶者進行了產(chǎn)前基因診斷。結(jié)果顯示胎兒不攜帶致病突變,為正常男性。 先天性無痛伴無汗(Congenial insensitive to pain with anhidrosis, CIPA, MIM256800),是一種很罕見的常染色體隱性遺傳病。CIPA患者典型的臨床表現(xiàn)為對傷害性刺激無反應(yīng),無汗,屢現(xiàn)的高熱,自我傷害行為及智力遲緩。CIPA的致病基因為神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體I型(Human neurotrophic tyrpsine kinase receptor type1, NTRK1),定位于1q21-22,編碼含790或796個氨基酸殘基的受體酪氨酸激酶TRKA。對于我們收集到的兩個CIPA家系,我們對家系內(nèi)患者NTRK1基因各外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界處進行PCR擴增后直接測序。在家系1先證者NTRK1基因上發(fā)現(xiàn)三個錯義突變(p.P397L, p.R692C, p.R771C),均為國際首報。其中P397L和R771C突變來自先證者的母親,而由于先證者的父親并不攜帶R692C突變,我們推測該突變可能是新生突變或者父親是該突變的嵌合體。通過PCR產(chǎn)物酶切的方法,我們在70名正常對照個體中分別對這 個突變進行了驗證。隨后我們采用在線預(yù)測工具SIFT和Polyphen對三個錯義突變的致病性進行了預(yù)測,預(yù)測結(jié)果顯示R692C和R771C的致病性要強于P397L。另外,我們在家系2先證者NTRK1基因上發(fā)現(xiàn)了一個已知的純合突變,c.287+2dupT,其父母均為此突變的攜帶者。我們的發(fā)現(xiàn)有助于對這兩個家系進行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷,同時新的突變也擴展了NTRK1的突變譜。 總之,對于這三種遺傳性皮膚病,我們采用了不同方法對其進行了致病突變研究。通過對BDCS連鎖區(qū)域的致病突變篩查,我們基本排除了BDCS是由連鎖區(qū)域內(nèi)外顯子組區(qū)域突變致病的可能。通過對連鎖區(qū)域內(nèi)拷貝數(shù)分析,‘發(fā)現(xiàn)了兩個家系患者Xq26.1-q26.2之間存在拷貝數(shù)的增加,其致病性需要進一步確定。我們對XLHED和CIPA家系分別進行了致病基因突變檢測,鑒定出了每個家系的致病突變,包括5個新突變。我們的檢測結(jié)果有助于為患者家系提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷,同時所發(fā)現(xiàn)的新的突變也擴展了EDA、NTRK1基因突變譜。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R723.14

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 牟曉冬;張志s，

本文編號：2474560