【摘要】：研究背景 支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早產(chǎn)兒生后由于急性呼吸窘迫長期應(yīng)用高濃度氧氣和呼吸機輔助通氣治療后的一種慢性肺部疾病,常常引起嚴(yán)重并發(fā)癥,導(dǎo)致患兒長期依賴氧氣,存活患兒常伴隨有慢性肺功能障礙和氣體交換障礙,易發(fā)生呼吸道感染、精神與運動發(fā)育落后及喂養(yǎng)困難等,后期可出現(xiàn)運動障礙、腦癱、聽力喪失等殘疾,嚴(yán)重影響患兒生存質(zhì)量。近年來遺傳生殖工程技術(shù)迅速發(fā)展,試管嬰兒、多胞胎比例明顯增加,以及環(huán)境因素及其他多種原因,隨之不可避免的早產(chǎn)兒尤其是超早產(chǎn)兒明顯增多,臨床上機械通氣和肺表面活性物質(zhì)的廣泛應(yīng)用,早產(chǎn)兒救治水平和管理技術(shù)的日益提高,目前極低體重兒和超低出生體重兒的存活率有了顯著改善,隨之而來的幸存者常見肺部并發(fā)癥BPD的發(fā)病率必然呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,從而BPD成為新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(Neonatal Intensive Care Unit, NICU)所面臨的最常見而又最為棘手的問題之一,也是嬰幼兒時期最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,嚴(yán)重影響早產(chǎn)兒的存活率和生活質(zhì)量。由于BPD的定義和診斷標(biāo)準(zhǔn)方面沒有完全統(tǒng)一,國內(nèi)外對BPD的發(fā)病率報道不一。目前BPD多見于極不成熟早產(chǎn)兒。Stevenson報道在體重不足1000g的早產(chǎn)兒中,其發(fā)病率高達(dá)30%。因此,目前BPD的早期診治和預(yù)防已成為臨床上一個十分重要的課題,其早期干預(yù)及治療意義重大。鑒于BPD患兒有較高的入院率與死亡率,其確切致病因素及致病機理尚未完全明了,故而其發(fā)病機制、預(yù)防和治療方法的研究一直是新生兒醫(yī)學(xué)和呼吸病學(xué)的熱點。但目前BPD尚缺乏有效的預(yù)防措施,有部分患兒治療效果不佳,長期不能脫氧,常因反復(fù)感染而死亡,后期生活質(zhì)量不高,因此對此進(jìn)行研究,探索有效的預(yù)防和治療措施,尋找有效的早期干預(yù)及治療途徑意義重大,將有助于減少兒童致殘率,提高患兒存活率和生活質(zhì)量。 研究發(fā)現(xiàn)機械通氣和高濃度氧氣可使早產(chǎn)狒狒和羊的肺泡面積明顯減少,肺血管出現(xiàn)形態(tài)異常改變,嚴(yán)重減少肺泡數(shù)量,阻礙肺泡和肺血管的發(fā)育。且早產(chǎn)兒肺泡化未完成,肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)系統(tǒng)和內(nèi)源性抗過氧化酶(過氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶、催化酶等)系統(tǒng)發(fā)育不成熟,其活性相對缺陷,更容易導(dǎo)致過氧化損害,使用高濃度氧氣的BPD早產(chǎn)兒可出現(xiàn)更持續(xù)的肺部疾病,使囊泡階段的肺發(fā)育停滯。同時高氧肺損傷后肺部白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞滲出增加,許多的促炎癥細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-1、6、8,腫瘤壞死因子a,血小板活化因子等)和趨炎因子釋放,炎癥形成了BPD的中心,限制了出生后肺泡、小呼吸道和小血管的發(fā)育,抑制出生后的肺泡化,從而導(dǎo)致肺發(fā)育停滯。 BPD的發(fā)病機制較為復(fù)雜,其確切致病因素及致病機理目前尚未完全明了,其高危致病因素主要包括：長時間高濃度吸氧導(dǎo)致氧中毒,呼吸機輔助機械通氣引起的氣壓傷和容量傷,早產(chǎn)兒肺發(fā)育的不成熟,感染炎癥所導(dǎo)致的肺損傷,以及遺傳因素等。其中肺發(fā)育的不成熟和氧中毒是最關(guān)鍵的致病因素。在醫(yī)學(xué)界已經(jīng)得到普遍認(rèn)同,吸入高濃度氧是引起早產(chǎn)兒BPD的主要原因之一。國內(nèi)外研究認(rèn)為肺發(fā)育停滯是其主要的病理改變。既往BPD的發(fā)病機制的報道多著重于肺泡化障礙的機制研究,然而肺發(fā)育包括肺泡發(fā)育和血管發(fā)育兩個方面,肺發(fā)育階段肺泡分化的同時微血管網(wǎng)同步擴展,形成有效的氣血交換屏障。越來越多的證據(jù)表明肺血管在發(fā)育過程中主動促進(jìn)肺泡的正常生長,并且在生后參與對肺泡結(jié)構(gòu)的維持。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素(Angiopoietin, Ang)是肺發(fā)育過程中肺血管發(fā)育最重要的兩種因子。 VEGF是一種多功能的細(xì)胞因子,是整個胚胎期、胎兒期和生后肺血管生長與維持的最有力和最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子,并參與了新生兒高氧肺損傷的發(fā)生。Ang是特異性作用于血管內(nèi)皮的血管生長因子。VEGF主要作用于肺血管形成的早期,促進(jìn)原始血管網(wǎng)的形成；Ang-1作用于肺血管重建、塑形,促進(jìn)成熟而有空間結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)的形成。動物實驗表明VEGF和Ang可能具有協(xié)同作用。Ang-2可能通過抑制Ang-1來增強內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF的反應(yīng)。Ang-2可拮抗Ang-1促血管穩(wěn)定的作用,消除血管基底膜和管周細(xì)胞對血管形成的限制,并增加內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF的敏感性,有利于血管出芽、生長；血管內(nèi)皮細(xì)胞上Ang-2可以通過抑制Ang-1活化程度,形成內(nèi)分泌調(diào)節(jié)環(huán)路,來維持血管生長、退化的動態(tài)平衡,而且Ang-2的表達(dá)也受VEGF的調(diào)節(jié)。Ang還與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。研究表明,Ang-1可抑制人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡且存在劑量依賴關(guān)系,并與VEGF有協(xié)同效應(yīng)。目前研究證明Ang-3也受到VEGF的調(diào)控,Motoi等研究顯示VEGF可上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Ang-3的表達(dá),并且下調(diào)Ang-2的表達(dá)。Ang-1還是一種很好的抗炎因子。Gamble等研究顯示,Ang-1能加強內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì),管周細(xì)胞間的連接,維持血管內(nèi)皮細(xì)胞單層緊密排列的形態(tài),有效防止血漿外漏,Ang-1還能抑制由VEGF誘發(fā)血管滲漏導(dǎo)致的組織水腫。Ang和VEGF間的相互作用對血管成熟是很重要的,但它們間的相互作用很復(fù)雜并且與許多因素有關(guān),目前尚不明確。研究VEGF、Ang在高氧誘導(dǎo)新生鼠肺損傷時的動態(tài)表達(dá)及其對肺發(fā)育影響為支氣管發(fā)育不良的相關(guān)機制研究及改善肺發(fā)育障礙等方面奠定了實驗基礎(chǔ)。 實時熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的一項新的核酸檢測技術(shù)。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前已得到廣泛應(yīng)用。免疫印跡(immunoblotting)又稱為蛋白質(zhì)印跡(Western blotting),是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù),是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。采用實時熒光定量PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測高氧誘導(dǎo)新生SD大鼠肺損傷時肺組織中VEGF和Ang基因和蛋白的動態(tài)表達(dá)水平,有助于進(jìn)一步證實高氧肺損傷時VEGF和Ang在肺損傷中的作用及其對肺發(fā)育的影響。 合適的實驗動物模型是研究BPD的關(guān)鍵。大型靈長類動物如早產(chǎn)狒狒和羊其肺發(fā)育與人類相似,且可以進(jìn)行呼吸機輔助機械通氣,是有價值的實驗研究動物,但由于價格昂貴,需要較高技術(shù)的監(jiān)護(hù)設(shè)備,實施起來存在較大困難。而小型啃噬類動物如大鼠、小鼠等由于其價格方面和管理方面的優(yōu)勢已被廣泛用于高氧肺損傷及BPD的實驗動物模型的研究。研究顯示新生SD大鼠出生后2-3天日齡相當(dāng)于人類新生兒期。已有文獻(xiàn)對亞致死濃度(85%)和中等氧濃度(50%～65%)對肺發(fā)育阻滯和高氧肺損傷進(jìn)行研究,但實驗所需時間較長,多為2～4周,而致死濃度(90%)更容易造成肺損傷,更符合研究需要。95%高濃度氧是研究動物高氧肺損傷常用的濃度,短期可造成肺急性炎性改變,延長給氧時間則可能導(dǎo)致肺形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。本研究動物實驗的預(yù)實驗結(jié)果顯示本研究建立高氧誘導(dǎo)新生Sprague-Dawley大鼠肺損傷模型的預(yù)實驗結(jié)果顯示,高氧組第7天肺組織表現(xiàn)類似BPD的病理改變。故本課題采用95%高濃度氧氣暴露誘導(dǎo)2-3天日齡的新生SD大鼠肺損傷建立BPD實驗動物模型。 研究目的 1.通過建立高氧損傷誘導(dǎo)的新生鼠BPD模型,觀察高氧暴露后的新生大鼠肺組 織形態(tài)學(xué)改變情況,從肺血管發(fā)育的角度進(jìn)一步揭示BPD發(fā)生的病理機制； 2.探討VEGF、Ang在肺血管發(fā)育中的動態(tài)表達(dá)以及與高氧誘導(dǎo)肺損傷致支氣管 肺發(fā)育不良的關(guān)系,為完善早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生機制及尋求有效的防治途徑提供實驗依據(jù),以期應(yīng)用于臨床實驗研究,從而改善BPD患兒的預(yù)后,提高早產(chǎn)兒的存活率和生活質(zhì)量。 研究內(nèi)容和方法 1.首先建立新生鼠高氧肺損傷的實驗動物模型：以新生2-3天日齡SD大鼠為研究對象,雌雄不限,高濃度氧(≥95%)暴露1天、3天和7天,并建立BPD高氧肺損傷的動物模型(高濃度氧≥95%7天)； 2.將新生SD大鼠正常對照組和高氧損傷組平均分為3個小組；高氧損傷組分別高濃度氧(≥95%)暴露1天、3天和7天,利用光學(xué)顯微鏡動態(tài)觀察各組肺組織形態(tài)學(xué)變化； 3.設(shè)計引物和內(nèi)參照,用實時熒光定量PCR (RT-PCR)方法和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting)半定量檢測各時點樣本VEGF、Ang mRNA和蛋白的表達(dá)；結(jié)合肺組織形態(tài)學(xué)變化,評價高氧肺損傷時VEGF、Ang表達(dá)及其對肺發(fā)育的影響。 結(jié)果 1.新生SD大鼠高氧肺損傷BPD模型的構(gòu)建：新生2-3天SD大鼠持續(xù)≥95%的高氧暴露7天,表現(xiàn)為活動減少,反應(yīng)遲鈍,體重和身長均增長緩慢,高氧損傷組與正常對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.光學(xué)顯微鏡動態(tài)觀察各組肺組織形態(tài)學(xué)變化：低倍光鏡下觀察正常對照組新生鼠肺組織未見病理改變,表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)清楚、大小均一,無液體和炎性滲出；高氧損傷組第1天、第3天和第7天肺組織形態(tài)逐漸出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)簡單化、肺泡數(shù)目明顯減少,肺泡大小不均,肺泡壁較薄,有些肺泡融合、體積增加；高倍鏡觀察,正常對照組肺泡壁完整,肺泡內(nèi)未見明顯脫落細(xì)胞；高氧損傷組新生鼠肺泡中見有紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞滲出,并可見脫落的肺上皮細(xì)胞。高氧損傷組與正常對照組比較逐漸表現(xiàn)出肺泡數(shù)目減少,直徑變大,肺泡面積減小,肺泡間隔厚度減小,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.正常對照組第1天、第3天和第7天VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)：正常對照組第1天、第3天和第7天VEGF mRNA相對含量分別為：1.000±0.366、0.931±0.370、0.722±0.372；正常對照組第1天、第3天和第7天VEGF蛋白相對含量分別為：1.000±0.498、0.787+0.544、0.632±0.289；正常組第1天、第3天和第7天VEGF mRNA和蛋白相對含量比較,均無顯著性差異(P0.05)。 4.正常對照組第1天、第3天和第7天Ang mRNA和蛋白的表達(dá)：正常對照組第1天、第3天和第7天Ang mRNA相對含量分別為：1.000-±1.108、0.907±1.019、0.828±0.462;正常對照組第1天、第3天和第7天Ang蛋白相對含量分別為：1.000-±0.858、0.995±0.871、0.573±0.436；正常組第1天、第3天和第7天Ang mRNA和蛋白相對含量比較,均無顯著性差異(P0.05)。 5.高氧損傷組第1天、第3天和第7天VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)：高氧損傷組第1天、第3天和第7天VEGF mRNA相對含量分別為：0.985±0.403、0.897±0.512、0.239±0.293；高氧損傷組第1天、第3天和第7天VEGF蛋白相對含量分別為：0.960±0.619、0.730±0.342、0.358±0.128；高氧損傷組第7天新生鼠肺組織VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯低于正常對照組第7天,存在顯著差異(P0.05)。 6.高氧損傷組第1天、第3天和第7天天Ang mRNA和蛋白的表達(dá)：高氧損傷組第1天、第3天和第7天Ang mRNA相對含量分別為：1.011±1.131、0.843±0.388、0.327±0.184；高氧損傷組第1天、第3天和第7天Ang蛋白相對含量分別為：0.755±0.414、0.711±0.539、0.204±0.068；高氧損傷組第7天新生鼠肺組織Ang mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯低于正常對照組第7天,存在顯著差異(P0.05)。 結(jié)論 1.通過新生2-3天日齡SD大鼠持續(xù)吸入高濃度氧氣(≥95%)7天可構(gòu)建BPD高氧肺損傷的動物模型。 2.正常新生SD大鼠肺組織中VEGF、Ang表達(dá)呈動態(tài)變化趨勢,提示VEGF、Ang在肺組織的動態(tài)表達(dá)與肺發(fā)育之間有著密切關(guān)系,進(jìn)一步說明VEGF、Ang參與了肺發(fā)育過程。 3.高氧可誘導(dǎo)支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)生,隨著高氧暴露時間的延長,高氧肺損傷時VEGF、Ang mRNA和蛋白表達(dá)均明顯減少,光鏡下肺組織形態(tài)逐漸呈現(xiàn)高氧肺損傷時肺泡發(fā)育停滯的肺部病理改變,提示高氧肺損傷時VEGF、Ang表達(dá)減少可能通過阻礙肺發(fā)育參與BPD模型鼠高氧肺損傷的發(fā)生機制,為BPD的早期干預(yù)奠定實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R722.1

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本文編號：2447726