【摘要】：目的 嬰幼兒在經(jīng)歷過采用深低溫低流量(DHLF)體外循環(huán)(CPB)轉(zhuǎn)機方法的心臟手術(shù)后,由于多種病理生理原因,其肺損傷往往較年長兒嚴(yán)重,已成為患兒術(shù)后并發(fā)癥的主要死因。近年來,有臨床及實驗報道,體外循環(huán)期間經(jīng)肺動脈灌注肺保護液可減輕體外循環(huán)所造成的肺損傷。深低溫低流量體外循環(huán)中未成熟肺損傷機制研究還不十分完善,在肺保護液的選擇上尚無定論。目前,人們發(fā)現(xiàn)microRNA作為一類重要的基因調(diào)控因子在多種病理生理過程和疾病中發(fā)揮著多效作用。 本研究中,我們從臨床出發(fā),通過建立穩(wěn)定的乳豬深低溫低流量體外循環(huán)模型,向肺動脈灌注烏司他丁肺保護液,探討其對深低溫低流量體外循環(huán)下未成熟肺臟的保護作用。并檢測肺組織microRNA表達譜變化及對其潛在調(diào)控的靶基因和相關(guān)功能進行研究,進而為肺保護的研究提供理論依據(jù)。 方法 15只乳豬(14-21天,2.4-7.Okg)隨機分為深低溫低流量體外循環(huán)致肺損傷組(C組)、不含烏司他丁肺保護液灌注組(P組)、烏司他丁肺保護液灌注組(U組),各5例。均模擬臨床操作建立體外循環(huán)模型。P組及U組于主動脈阻斷心臟灌停后經(jīng)肺動脈分別灌注不含烏司他丁肺保護液和烏司他丁肺保護液,C組無保護液灌注,主動脈阻斷時間2小時期間使用深低溫低流量(25℃,50ml/kg/min)轉(zhuǎn)機1小時,維持循環(huán)穩(wěn)定2小時。分別于CPB轉(zhuǎn)機前,CPB停機、停機后1小時、2小時檢測血流動力學(xué)指標(biāo),通氣情況,血氣變化,計算相關(guān)呼吸參數(shù)以比較和評價肺功能改變,同期各時間點抽取5ml肺靜脈血離心后提取血清,實驗結(jié)束后取右下肺組織勻漿離心提取上清,ELISA法測定血清及肺組織中腫瘤壞死因子a (TNF-αa),白細胞介素6(IL-6),白細胞介素10(IL-10),髓過氧化物(MPO),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)含量,EMSA法檢測肺組織中核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)的活性,并對肺組織病理學(xué)評分、細胞凋亡情況、肺濕重干重比值進行比較。同時使用microRNA芯片技術(shù)對C組及U組肺組織miRNA表達與同齡同體重正常乳豬肺組織進行檢測比較,篩選差異表達的microRNA,選取差異較明顯的microRNA實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)進行驗證。使用miRanda預(yù)測潛在靶基因,運用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達miRNA的可能靶基因進行Gene Ontology分析和KEGG信號通路分析,并以qRT-PCR和ELISA分別檢測肺組織中可能靶基因的表達。 結(jié)果 DHLF-CPB模型建立穩(wěn)定成功,所有乳豬均出現(xiàn)肺損傷,并無明顯血流動力學(xué)差異。實驗終點時U組中肺功能指標(biāo)、病理學(xué)評分明顯優(yōu)于C組及P組,同時濕干比及凋亡細胞比例較該兩組明顯降低。ELISA結(jié)果顯示U組在實驗終點時肺靜脈血清中TNF-α,IL-6,MPO水平明顯低于C組及P組,IL。-10,SOD水平則明顯高于C組及P組,肺組織中IL-6,MPO含量明顯低于C組及P組,IL-10,SOD含量明顯高于C組及P組。實驗終點時血清中MDA表達及組織TNF α,MDA含量U組與P組相比無明顯差異,但均明顯低于C組。EMSA結(jié)果顯示U組NF-κ B活性要明顯低于C組及P組。 通過miRNA microarray技術(shù)檢測,同正常乳豬肺組織miRNA表達相比,C組中16個miRNAs,U組中8個miRNAs的表達發(fā)生了顯著改變(P0.05),運用熒光定量PCR對miR-21, miR-127, miR-145, miR-204表達進行驗證,C組中,miR-127, miR-145,miR-204的水平明顯降低,miR-21水平明顯上升,U組除miR-204表達變化無統(tǒng)計學(xué)差異,其余miRNAs變化趨勢與C組相同,具有統(tǒng)計學(xué)差異。與C組相比,U組miR-127,miR-204表達均抬高,miR-21表達降低。通過對miRanda預(yù)測的miRNA靶點進行歸類分析,得到在體外循環(huán)肺損傷期間相關(guān)的重要通路,包括T細胞受體信號通路,P13K-Akt-NF-K B信號通路,RAS通路。預(yù)測靶基因磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3CG)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2) PCR驗證和ELISA檢測結(jié)果均提示U組ACE、PTGS2表達水平及C組PIK3CG、ACE、PTGS2均明顯升高。同時,U組ACE、PTGS2、PIK3CG表達水平均較C組顯著降低。 結(jié)論 深低溫低流量體外循環(huán)術(shù)后可造成嚴(yán)重的肺損傷,烏司他丁肺保護液能較好地改善未成熟肺肺功能指標(biāo),減輕炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激,減少肺內(nèi)細胞凋亡,減輕肺損傷,可能與其抑制NF-K B活性有關(guān)。miRNA表達變化提示miRNA參與肺損傷和肺動脈灌注肺保護的過程。C組和U組肺組織中可能具有抑炎作用的miR-127,miR-145, miR-204表達下調(diào)與促炎作用的miR-21表達上調(diào),提示miRNA參與肺損傷的作用機制與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激密切相關(guān)。而U組中miRNA變化程度均小于C組,說明烏司他丁肺灌注液可調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA達到肺保護的效果。通過對miRNA及其相關(guān)分子通路的發(fā)現(xiàn)將有助于今后我們對體外循環(huán)肺損傷機制研究及肺保護的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R726.5

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本文編號：2445782