【摘要】：目的 嬰幼兒在經(jīng)歷過(guò)采用深低溫低流量(DHLF)體外循環(huán)(CPB)轉(zhuǎn)機(jī)方法的心臟手術(shù)后,由于多種病理生理原因,其肺損傷往往較年長(zhǎng)兒嚴(yán)重,已成為患兒術(shù)后并發(fā)癥的主要死因。近年來(lái),有臨床及實(shí)驗(yàn)報(bào)道,體外循環(huán)期間經(jīng)肺動(dòng)脈灌注肺保護(hù)液可減輕體外循環(huán)所造成的肺損傷。深低溫低流量體外循環(huán)中未成熟肺損傷機(jī)制研究還不十分完善,在肺保護(hù)液的選擇上尚無(wú)定論。目前,人們發(fā)現(xiàn)microRNA作為一類重要的基因調(diào)控因子在多種病理生理過(guò)程和疾病中發(fā)揮著多效作用。 本研究中,我們從臨床出發(fā),通過(guò)建立穩(wěn)定的乳豬深低溫低流量體外循環(huán)模型,向肺動(dòng)脈灌注烏司他丁肺保護(hù)液,探討其對(duì)深低溫低流量體外循環(huán)下未成熟肺臟的保護(hù)作用。并檢測(cè)肺組織microRNA表達(dá)譜變化及對(duì)其潛在調(diào)控的靶基因和相關(guān)功能進(jìn)行研究,進(jìn)而為肺保護(hù)的研究提供理論依據(jù)。 方法 15只乳豬(14-21天,2.4-7.Okg)隨機(jī)分為深低溫低流量體外循環(huán)致肺損傷組(C組)、不含烏司他丁肺保護(hù)液灌注組(P組)、烏司他丁肺保護(hù)液灌注組(U組),各5例。均模擬臨床操作建立體外循環(huán)模型。P組及U組于主動(dòng)脈阻斷心臟灌停后經(jīng)肺動(dòng)脈分別灌注不含烏司他丁肺保護(hù)液和烏司他丁肺保護(hù)液,C組無(wú)保護(hù)液灌注,主動(dòng)脈阻斷時(shí)間2小時(shí)期間使用深低溫低流量(25℃,50ml/kg/min)轉(zhuǎn)機(jī)1小時(shí),維持循環(huán)穩(wěn)定2小時(shí)。分別于CPB轉(zhuǎn)機(jī)前,CPB停機(jī)、停機(jī)后1小時(shí)、2小時(shí)檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),通氣情況,血?dú)庾兓?計(jì)算相關(guān)呼吸參數(shù)以比較和評(píng)價(jià)肺功能改變,同期各時(shí)間點(diǎn)抽取5ml肺靜脈血離心后提取血清,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取右下肺組織勻漿離心提取上清,ELISA法測(cè)定血清及肺組織中腫瘤壞死因子a (TNF-αa),白細(xì)胞介素6(IL-6),白細(xì)胞介素10(IL-10),髓過(guò)氧化物(MPO),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)含量,EMSA法檢測(cè)肺組織中核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)的活性,并對(duì)肺組織病理學(xué)評(píng)分、細(xì)胞凋亡情況、肺濕重干重比值進(jìn)行比較。同時(shí)使用microRNA芯片技術(shù)對(duì)C組及U組肺組織miRNA表達(dá)與同齡同體重正常乳豬肺組織進(jìn)行檢測(cè)比較,篩選差異表達(dá)的microRNA,選取差異較明顯的microRNA實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)進(jìn)行驗(yàn)證。使用miRanda預(yù)測(cè)潛在靶基因,運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)miRNA的可能靶基因進(jìn)行Gene Ontology分析和KEGG信號(hào)通路分析,并以qRT-PCR和ELISA分別檢測(cè)肺組織中可能靶基因的表達(dá)。 結(jié)果 DHLF-CPB模型建立穩(wěn)定成功,所有乳豬均出現(xiàn)肺損傷,并無(wú)明顯血流動(dòng)力學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)U組中肺功能指標(biāo)、病理學(xué)評(píng)分明顯優(yōu)于C組及P組,同時(shí)濕干比及凋亡細(xì)胞比例較該兩組明顯降低。ELISA結(jié)果顯示U組在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)肺靜脈血清中TNF-α,IL-6,MPO水平明顯低于C組及P組,IL。-10,SOD水平則明顯高于C組及P組,肺組織中IL-6,MPO含量明顯低于C組及P組,IL-10,SOD含量明顯高于C組及P組。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)血清中MDA表達(dá)及組織TNF α,MDA含量U組與P組相比無(wú)明顯差異,但均明顯低于C組。EMSA結(jié)果顯示U組NF-κ B活性要明顯低于C組及P組。 通過(guò)miRNA microarray技術(shù)檢測(cè),同正常乳豬肺組織miRNA表達(dá)相比,C組中16個(gè)miRNAs,U組中8個(gè)miRNAs的表達(dá)發(fā)生了顯著改變(P0.05),運(yùn)用熒光定量PCR對(duì)miR-21, miR-127, miR-145, miR-204表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,C組中,miR-127, miR-145,miR-204的水平明顯降低,miR-21水平明顯上升,U組除miR-204表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余miRNAs變化趨勢(shì)與C組相同,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與C組相比,U組miR-127,miR-204表達(dá)均抬高,miR-21表達(dá)降低。通過(guò)對(duì)miRanda預(yù)測(cè)的miRNA靶點(diǎn)進(jìn)行歸類分析,得到在體外循環(huán)肺損傷期間相關(guān)的重要通路,包括T細(xì)胞受體信號(hào)通路,P13K-Akt-NF-K B信號(hào)通路,RAS通路。預(yù)測(cè)靶基因磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3CG)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2) PCR驗(yàn)證和ELISA檢測(cè)結(jié)果均提示U組ACE、PTGS2表達(dá)水平及C組PIK3CG、ACE、PTGS2均明顯升高。同時(shí),U組ACE、PTGS2、PIK3CG表達(dá)水平均較C組顯著降低。 結(jié)論 深低溫低流量體外循環(huán)術(shù)后可造成嚴(yán)重的肺損傷,烏司他丁肺保護(hù)液能較好地改善未成熟肺肺功能指標(biāo),減輕炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激,減少肺內(nèi)細(xì)胞凋亡,減輕肺損傷,可能與其抑制NF-K B活性有關(guān)。miRNA表達(dá)變化提示miRNA參與肺損傷和肺動(dòng)脈灌注肺保護(hù)的過(guò)程。C組和U組肺組織中可能具有抑炎作用的miR-127,miR-145, miR-204表達(dá)下調(diào)與促炎作用的miR-21表達(dá)上調(diào),提示miRNA參與肺損傷的作用機(jī)制與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激密切相關(guān)。而U組中miRNA變化程度均小于C組,說(shuō)明烏司他丁肺灌注液可調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA達(dá)到肺保護(hù)的效果。通過(guò)對(duì)miRNA及其相關(guān)分子通路的發(fā)現(xiàn)將有助于今后我們對(duì)體外循環(huán)肺損傷機(jī)制研究及肺保護(hù)的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R726.5

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本文編號(hào)：2445782