【摘要】：腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是嬰幼兒手足口病(hand, foot,and mouth disease, HFMD)的主要病原體之一。近期由EV71感染引起的手足口病在亞太地區(qū)的大規(guī)模爆發(fā),已經(jīng)成為一個(gè)為社會(huì)所關(guān)注的,嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。EV71感染嬰幼兒所引起的病癥一般較為溫和,但在少數(shù)情況下,EV71的感染可能導(dǎo)致病人出現(xiàn)重癥甚至死亡,而這些重癥病例通常表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的臨床特征,包括無菌性腦膜炎、急性遲緩性麻痹、腦干腦炎,并且常伴有相關(guān)的系統(tǒng)性癥狀,如嚴(yán)重的肺水腫和休克。由于EV71感染所導(dǎo)致的重癥病例的原因迄今尚不清楚,因此針對(duì)感染性疾病的臨床治療和預(yù)防工作仍有許多盲點(diǎn),而基于這一現(xiàn)狀的相關(guān)感染病理機(jī)制的進(jìn)一步研究,正是本次實(shí)驗(yàn)研究的主要目的所在。研究初期以EV71的FY-23株為模板,擴(kuò)增得到基因組全長cDNA并將其連接入pSP64載體中,使用體外轉(zhuǎn)錄體系得到EV71基因組的全長轉(zhuǎn)錄本,并將轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞從而得到EV71拯救病毒株。經(jīng)鑒定其遺傳特性、生長特性、致病性和免疫原性均與母株病毒性狀基本相似。在此基礎(chǔ)上,使用搭橋PCR技術(shù)將綠色熒光蛋白基因插入EV71的VP4基因中,獲得能夠穩(wěn)定傳代并表達(dá)綠色熒光蛋白的重組EV71病毒。利用該重組病毒在感染細(xì)胞的過程中能夠表達(dá)其熒光標(biāo)記的特性,我們可以在感染的恒河猴嬰猴動(dòng)物模型上直觀地觀察病毒感染部位和途徑。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦?已建立了恒河猴嬰猴EV71感染的動(dòng)物模型,該模型已被成功應(yīng)用于EV71致病機(jī)理及藥物開發(fā)研究。在本次實(shí)驗(yàn)中,試驗(yàn)分別通過呼吸道攻毒(鼻腔噴霧)和腸道攻毒(飲水)兩種途徑,使用104.5 CCID50/只的感染劑量對(duì)恒河猴嬰猴進(jìn)行攻毒,實(shí)驗(yàn)組使用的毒株為綠色熒光蛋白重組病毒,對(duì)照組毒株為具有野生表型的FY-23株。首先,我們發(fā)現(xiàn)兩種攻毒方式均能引起嬰猴體溫升高和病毒血癥,但呼吸道途徑攻毒方式所產(chǎn)生的病理特征更為明顯。在呼吸道攻毒的嬰猴中不僅表現(xiàn)出手足口部的皰疹,而且伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和肺水腫,這一特征與人類重癥病例癥狀極為相似。其次,從呼吸道途徑感染嬰猴的病理切片上觀察到明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸道系統(tǒng)器官病理改變。另外通過兩種途徑感染的嬰猴,其呼吸系統(tǒng)的病毒載量都有增加,而通過呼吸道途徑感染的嬰猴病毒載量升高較明顯,但二者在腸道中的病毒載量均無明顯增加。綜上所述,呼吸道途徑感染嬰猴所引起的病癥更為典型,因此,接下來重點(diǎn)研究呼吸道途徑感染恒河猴嬰猴的相關(guān)病理機(jī)制。利用冰凍切片和免疫熒光技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)在感染初期EV71主要在呼吸道上皮細(xì)胞和淋巴結(jié)中增殖,并且在稍晚時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦干部位觀察到病毒發(fā)出的綠色熒光。進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光共定位分析,結(jié)果表明EV71能夠感染樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC),在不同亞群的DC中EV71偏好于感染CD141+DC。實(shí)驗(yàn)表明在病毒感染早期,CD141+DC被募集至感染部位并被病毒侵染。隨后,DC可能搭載著病毒從最初的感染部位遷移至淋巴結(jié),進(jìn)一步隨循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等靶器官。EV71感染DC后能刺激其成熟,而感染過程并不影響機(jī)體的免疫反應(yīng)。與此同時(shí),恒河猴嬰猴DC在體外的感染實(shí)驗(yàn)亦映證了以上結(jié)論。綜上所述,本次實(shí)驗(yàn)使用反向遺傳學(xué)技術(shù)快速構(gòu)建得到綠色熒光蛋白重組EV71病毒,利用該病毒的熒光標(biāo)記觀察其在恒河猴嬰猴動(dòng)物模型上的感染途徑,從而進(jìn)一步闡明EV71致病機(jī)制,尤其是DC在病毒感染進(jìn)程中扮演的特殊角色。隨著實(shí)驗(yàn)研究的深入和病理機(jī)制的進(jìn)一步揭示,將為EV71感染引起重癥病例的防治帶來新的啟示。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R725.1

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本文編號(hào)：2428630