發(fā)布時間：2019-02-22 21:06

【摘要】：腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是嬰幼兒手足口病(hand, foot,and mouth disease, HFMD)的主要病原體之一。近期由EV71感染引起的手足口病在亞太地區(qū)的大規(guī)模爆發(fā),已經(jīng)成為一個為社會所關注的,嚴重的公共衛(wèi)生問題。EV71感染嬰幼兒所引起的病癥一般較為溫和,但在少數(shù)情況下,EV71的感染可能導致病人出現(xiàn)重癥甚至死亡,而這些重癥病例通常表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的臨床特征,包括無菌性腦膜炎、急性遲緩性麻痹、腦干腦炎,并且常伴有相關的系統(tǒng)性癥狀,如嚴重的肺水腫和休克。由于EV71感染所導致的重癥病例的原因迄今尚不清楚,因此針對感染性疾病的臨床治療和預防工作仍有許多盲點,而基于這一現(xiàn)狀的相關感染病理機制的進一步研究,正是本次實驗研究的主要目的所在。研究初期以EV71的FY-23株為模板,擴增得到基因組全長cDNA并將其連接入pSP64載體中,使用體外轉錄體系得到EV71基因組的全長轉錄本,并將轉錄本轉染Vero細胞從而得到EV71拯救病毒株。經(jīng)鑒定其遺傳特性、生長特性、致病性和免疫原性均與母株病毒性狀基本相似。在此基礎上,使用搭橋PCR技術將綠色熒光蛋白基因插入EV71的VP4基因中,獲得能夠穩(wěn)定傳代并表達綠色熒光蛋白的重組EV71病毒。利用該重組病毒在感染細胞的過程中能夠表達其熒光標記的特性,我們可以在感染的恒河猴嬰猴動物模型上直觀地觀察病毒感染部位和途徑。我們在前期的研究工作中,已建立了恒河猴嬰猴EV71感染的動物模型,該模型已被成功應用于EV71致病機理及藥物開發(fā)研究。在本次實驗中,試驗分別通過呼吸道攻毒(鼻腔噴霧)和腸道攻毒(飲水)兩種途徑,使用104.5 CCID50/只的感染劑量對恒河猴嬰猴進行攻毒,實驗組使用的毒株為綠色熒光蛋白重組病毒,對照組毒株為具有野生表型的FY-23株。首先,我們發(fā)現(xiàn)兩種攻毒方式均能引起嬰猴體溫升高和病毒血癥,但呼吸道途徑攻毒方式所產(chǎn)生的病理特征更為明顯。在呼吸道攻毒的嬰猴中不僅表現(xiàn)出手足口部的皰疹,而且伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應和肺水腫,這一特征與人類重癥病例癥狀極為相似。其次,從呼吸道途徑感染嬰猴的病理切片上觀察到明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸道系統(tǒng)器官病理改變。另外通過兩種途徑感染的嬰猴,其呼吸系統(tǒng)的病毒載量都有增加,而通過呼吸道途徑感染的嬰猴病毒載量升高較明顯,但二者在腸道中的病毒載量均無明顯增加。綜上所述,呼吸道途徑感染嬰猴所引起的病癥更為典型,因此,接下來重點研究呼吸道途徑感染恒河猴嬰猴的相關病理機制。利用冰凍切片和免疫熒光技術,我們發(fā)現(xiàn)在感染初期EV71主要在呼吸道上皮細胞和淋巴結中增殖,并且在稍晚時中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦干部位觀察到病毒發(fā)出的綠色熒光。進一步使用流式細胞術和免疫熒光共定位分析,結果表明EV71能夠感染樹突狀細胞(dendritic cell, DC),在不同亞群的DC中EV71偏好于感染CD141+DC。實驗表明在病毒感染早期,CD141+DC被募集至感染部位并被病毒侵染。隨后,DC可能搭載著病毒從最初的感染部位遷移至淋巴結,進一步隨循環(huán)系統(tǒng)到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)等靶器官。EV71感染DC后能刺激其成熟,而感染過程并不影響機體的免疫反應。與此同時,恒河猴嬰猴DC在體外的感染實驗亦映證了以上結論。綜上所述,本次實驗使用反向遺傳學技術快速構建得到綠色熒光蛋白重組EV71病毒,利用該病毒的熒光標記觀察其在恒河猴嬰猴動物模型上的感染途徑,從而進一步闡明EV71致病機制,尤其是DC在病毒感染進程中扮演的特殊角色。隨著實驗研究的深入和病理機制的進一步揭示,將為EV71感染引起重癥病例的防治帶來新的啟示。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R725.1

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本文編號：2428630