【摘要】：第一部分TRIM22對(duì)單核細(xì)胞凋亡的作用及其分子機(jī)制研究目的:TRIM22是TRIM蛋白家族成員,主要表達(dá)于人脾臟、胸腺等淋巴器官,以及外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),尤其高表達(dá)于單核細(xì)胞。研究表明TRIM22在抗病毒免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。且TRIM22是p53的靶基因,過表達(dá)TRIM22能抑制單核細(xì)胞U937的克隆性生長。因此我們推測(cè)TRIM22可能通過抑制單核細(xì)胞生長、促進(jìn)其死亡來參與免疫調(diào)節(jié)。因此本研究主要觀察高表達(dá)TRIM22對(duì)單核細(xì)胞凋亡的影響并探索TRIM22介導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。研究方法:構(gòu)建攜帶TRIM22基因的重組腺病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞。以高表達(dá)TRIM22的THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象,用星形孢菌素(staurosporine,STS)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,或在胞多糖(lipopolysaccharide,LPS,100ng/ml)體外模擬炎癥環(huán)境下,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平,Western blot方法檢測(cè)caspase-9、caspase-3蛋白的裂解激活和細(xì)胞色素C的釋放。采用化學(xué)抑制劑z-VAD-fmk阻斷caspase信號(hào)通路,觀察caspase信號(hào)通路對(duì)TRIM22分子介導(dǎo)的單核細(xì)胞凋亡的影響。Western blot法和化學(xué)交聯(lián)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平及寡聚化水平的變化。并進(jìn)一步在人原代單核細(xì)胞中,用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)檢測(cè) LPS 體外炎癥刺激下細(xì)胞凋亡過程中TRIM22與Bak的表達(dá)水平,并分析兩者之間的相關(guān)性。研究結(jié)果:TRIM22重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后能獲得高表達(dá)TRIM22的單核細(xì)胞。過表達(dá)TRIM22能顯著增加STS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的凋亡率(87.8%±6.4%vs.23.1%±9.4%,P0.01)。在LPS刺激體外模型炎癥環(huán)境下,高表達(dá)TRIM22也能促進(jìn) STS 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞凋亡(91.1%± 6.3%vs.25.5%± 14.3%,P0.01)。高表達(dá)TRIM22促進(jìn)了 caspase-9和caspase-3的裂解激活,導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放增加。經(jīng)z-VAD-fmk預(yù)處理阻斷caspase信號(hào)通路后,TRIM22的促凋亡作用被抑制(10.9%± 3,5%vs.82.6%± 22.3%,P0.01)。Bcl-2 蛋白家族中促凋亡蛋白 Bak 在TRIM22介導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)水平上調(diào),寡聚化程度增高。在LPS體外炎癥刺激下,人原代單核細(xì)胞凋亡過程中TRIM22與Bak的表達(dá)水平呈正相關(guān)(R=0.534,P0.0001)。研究結(jié)論:TRIM22對(duì)單核細(xì)胞具有促凋亡作用,其機(jī)制可能與上調(diào)Bak蛋白表達(dá),促進(jìn)Bak蛋白寡聚化有關(guān)。第二部分TRIM22發(fā)揮促凋亡作用的重要功能結(jié)構(gòu)域研究目的:既往研究表明RING結(jié)構(gòu)域和B30.2/SPRY結(jié)構(gòu)域是TRIM22發(fā)揮生物學(xué)功能的重要功能區(qū)域,前者具有E3泛素連接酶活性,與TRIM22抵抗多種病毒的作用密切相關(guān),后者決定TRIM22的細(xì)胞核定位及核體的形成,且兩者均是TRIM22發(fā)揮抗HBV活性及調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的重要功能結(jié)構(gòu)域。因此,本部分研究TRIM22的重要功能結(jié)構(gòu)域RING結(jié)構(gòu)域和SPRY結(jié)構(gòu)域在其促凋亡過程中的作用,從而探討TRIM22分子結(jié)構(gòu)與其促單核細(xì)胞凋亡功能的相關(guān)性。研究方法:構(gòu)建攜帶TRIM22野生型基因和結(jié)構(gòu)域缺失突變型基因的三個(gè)腺病毒載體Ad.TRIM22、Ad.TRIM22-ΔRING 和 Ad.TRIM22-ΔSPRY,后兩個(gè)分別代表 RING結(jié)構(gòu)域(64-498aa)或SPRY結(jié)構(gòu)域(1-352aa)缺失的TRIM22突變型腺病毒載體,轉(zhuǎn)染人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞,72小時(shí)后用Western blot法驗(yàn)證缺失突變型TRIM22在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)。用星形孢菌素(staurosporine,STS)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。用western blot法和化學(xué)交聯(lián)法檢測(cè)Bak蛋白表達(dá)水平和寡聚化程度。研究結(jié)果:Western blot檢測(cè)證實(shí)TRIM22突變型腺病毒載體構(gòu)建并轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞成功。與野生型TRIM22相比,RING結(jié)構(gòu)域缺失突變型和SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變型TRIM22對(duì)單核細(xì)胞的促凋亡作用均減弱(65.1%±6.6%vs.32%±11.3,P0.05;65.1%± 6.6%vs.31.3%± 10.5%,P0.05)。Western blot 結(jié)果顯示 RING 結(jié)構(gòu)域缺失和SPRY結(jié)構(gòu)域缺失使TRIM22介導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡過程中Bak表達(dá)的上調(diào)和寡聚化程度也均減弱。研究結(jié)論:RING和SPRY結(jié)構(gòu)域是TRIM22發(fā)揮促凋亡作用的重要功能區(qū)域。第三部分TRIM22在膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及其與單核細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究研究目的:第一部分研究發(fā)現(xiàn)TRIM22可以通過上調(diào)Bak蛋白的表達(dá),促進(jìn)Bak寡聚化,介導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡。單核細(xì)胞凋亡是膿毒癥過程中終止單核細(xì)胞活化,避免過度炎癥反應(yīng),維持機(jī)體正常免疫應(yīng)答狀態(tài)的重要機(jī)制。因而推測(cè)TRIM22可能通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞凋亡,從而在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此,本部分研究通過觀察成人及兒童膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞中TRIM22的表達(dá)水平及其與Bak蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性,探討TRIM22在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用。研究方法:本研究納入2013年5月至2013年7月大學(xué)附屬醫(yī)院外科加強(qiáng)監(jiān)護(hù)病房(Intensive Care Unit,ICU)內(nèi)符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的15例成人患者,并將同期8例非膿毒癥危重病患者作為對(duì)照組。納入2014年11月至2015年3月大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童加強(qiáng)監(jiān)護(hù)病房(Pediatric Intensive Care Unit,PICU)內(nèi)符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的10例患兒,并將同期14例非膿毒癥外科手術(shù)患兒作為對(duì)照組。所有納入患者均在確診膿毒癥后24小時(shí)內(nèi)抽取全血,分離外周血單核細(xì)胞,用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)檢測(cè) TRIM22 和Bak的表達(dá)水平。分別比較成人和兒童膿毒癥患者與其對(duì)照組單核細(xì)胞中TRIM22的表達(dá)水平的差異,分析兩者單核細(xì)胞中TRIM22與Bak表達(dá)水平的相關(guān)性。研究結(jié)果:成人膿毒癥患者單核細(xì)胞中TRIM22的表達(dá)水平低于對(duì)照組(P0.05),且與Bak分子表達(dá)水平呈正相關(guān)(R=0.6064,P=0.0006)。兒童膿毒癥患者單核細(xì)胞中TRIM22的表達(dá)水平也低于對(duì)照組(P0.05),并且TRIM22表達(dá)水平低的膿毒癥患兒,其Bak分子表達(dá)水平有下降的趨勢(shì)(R=0.5801,P=0.0787)。研究結(jié)論:膿毒癥患者單核細(xì)胞中TRIM22的表達(dá)水平降低,且與Bak的表達(dá)水平呈正相關(guān),提示TRIM22在膿毒癥單核細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R725

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Hui Qiu;Fang Huang;Han Xiao;Binlian Sun;Rongge Yang;;TRIM22 Inhibits the TRAF6-stimulated NF-κB Pathway by Targeting TAB2 for Degradation[J];Virologica Sinica;2013年04期

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本文編號(hào)：2417667