【摘要】：研究背景： 急性白血病是造血系統(tǒng)的惡性增生性疾病,是一種造血干／祖細胞發(fā)生惡性變的異質(zhì)性造血系統(tǒng)腫瘤,以異常造血細胞的惡性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血細胞減少為特征,居我國兒童惡性腫瘤發(fā)病的首位。其中急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)約占兒童急性白血病的25-30%。除急性早幼粒細胞白血病外,其余各型雖化療可使75%以上患兒獲得臨床緩解,但其5年無病存活率仍較低。因此尋找和探索治療急性髓細胞白血病的新療法,改善兒童髓細胞白血病患兒的預后,降低病死率,是全世界血液學工作者迫切需要解決的研究課題,也是當前我們兒科領(lǐng)域中的一項重要工作。 近年來,隨著細胞生物學和分子生物學等生命科學的發(fā)展,人們對白血病的認識越來越深入,對AML發(fā)生機制及治療的研究已經(jīng)深入到分子水平,研究者們發(fā)現(xiàn)AML細胞內(nèi)存在基因缺陷或表達異常,同時也有生化和免疫學方面的改變。因此基于AML細胞與正常細胞在分子水平上的差異,如何利用AML的生物標志物,通過分子生物學技術(shù)在其早期診斷、治療和判斷預后上發(fā)揮更大的作用已經(jīng)成為基礎(chǔ)和臨床研究的熱點。 自分泌運動因子受體(autocrine motility factor receptor, AMFR)是學者早年從鼠黑素瘤細胞中提取出的一種細胞表面糖蛋白,又名gp78,同時它又屬于泛素蛋白酶體系統(tǒng)蛋白,其部分一級結(jié)構(gòu)與腫瘤蛋白p53相似,與自分泌運動因子(autocrine motility factor, AMF)結(jié)合可促進細胞的遷移和運動。而且研究發(fā)現(xiàn)AMFR是以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)環(huán)指結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的泛素蛋白連接酶(E3),可通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放而阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激效應及細胞凋亡,證實了AMFR是連接泛素化、ER降解以及腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在樞紐。 AMF/AMFR在胃癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性實體瘤中被關(guān)注,證實其與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預后等密切相關(guān)。而AMFR作為泛素蛋白酶體系統(tǒng)蛋白,它在細胞增殖與細胞凋亡調(diào)控等方面的作用較少有人研究,在血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面也鮮有人問津。 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來新興的基因技術(shù),它是指通過外界人為干預,將人工合成的與內(nèi)源性mRNA特異性互補的雙鏈RNA導入細胞,引起特定序列的nRNA降解,靶向抑制基因表達,從而達到基因治療的目的,以其自身高效、特異、細胞毒性低等特點受到廣大科學工作者的青睞。研究目的： 本研究旨在探索AWFR在兒童急性白血病中是否存在異常表達,并通過特異性AMFR-siRNA轉(zhuǎn)染AML細胞株,初步探索AMFR作為泛素蛋白酶體系統(tǒng),對急性髓細胞白血病細胞株細胞周期和細胞凋亡等方面的影響及在AML中的作用機制。 研究方法： 1AMFR在兒童急性白血病中的表達檢測 收集初治急性白血病患兒及健康對照組新鮮骨髓標本,分為ALL組、AML組及健康對照組。培養(yǎng)AML細胞株THP-1、HL60和K562,并以健康人骨髓單個核細胞為對照。分別提取新鮮骨髓單個核細胞及各細胞株細胞中的總RNA,實時熒光定量PCR法擴增AMFR基因,檢測(?)AMFR在急性白血病患兒原代骨髓細胞及AML細胞株中的相對表達量。 2AMFR-siRNA轉(zhuǎn)染THP-1細胞 選擇異常表達AMFR基因的急性單核細胞白血病細胞株THP-1,體外培養(yǎng)后,以處于指數(shù)生長期的細胞為實驗對象,按說明轉(zhuǎn)染AMFR-siRNA及無關(guān)對照siRNA(control-siRNA)。具體分組：①空白對照組,使用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基處理細胞；②陰性對照組,無關(guān)陰性FICT熒光標記的control siRNA轉(zhuǎn)染細胞；③實驗組,采用特異性AMFR-siRNA轉(zhuǎn)染THP-1細胞。實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染后各時間點每組細胞AMFR基因水平的表達；于最佳作用時間點檢測Rock-2基因表達量、細胞周期及CyclinD1基因水平,以及Annexin V/PI法測細胞凋亡及凋亡調(diào)控基因Bcl-2表達。實驗結(jié)果 1AMFR急性白血病骨髓原代細胞水平及AML細胞株水平的表達 相對定量RQ-PCR法對AMFR基因表達分析,發(fā)現(xiàn)AMFR在ALL、AML及健康患兒新鮮骨髓標本中相對表達量為4.02±1.77、2.93±1.28、0.99±0.05(x=16.852,p＜0.001),ALL組和AML組間比較差異有統(tǒng)計學意義(p=0.044),且都較健康對照組高(p＜0.001,p=0.003)。THP-1、HL60、K562細胞株及健康對照組中的相對表達量分別為4.34±1.01、3.91±0.73、2.94±0.59、0.98±0.05(x=28.0067,p＜0.001)。兩兩比較THP-1組和HL60組無差異(p=0.174)；THP-1組與K562組,HL60組與K562組差異有統(tǒng)計學意義p值分別為0.001、0.003。 2AMFR-siRNA對THP-1細胞中AMFR基因干擾效應的檢測 RQ-PCR結(jié)果顯示,AMFR-siRNA在轉(zhuǎn)染后48小時開始起作用,72h時作用最明顯,實驗觀察到96h,抑制效應已經(jīng)明顯減弱(F=261.333,p＜0.001)。72h control siRNA組和AMFR-siRNA組相對基因表達量分別為1.03±0.06、0.49±0.02(t=16.364,p=0.002) 3AMFR-siRNA對THP-1細胞中Rock-2基因的影響 于轉(zhuǎn)染后72小時,測得AMFR-siRNA組ROCK-2mRNA相對表達水平為0.73±0.19,相對于congtrol siRNA組1.01±0.07,明顯下調(diào)(t=4.212,p=0.002)。 4AMFR-siRNA對THP-1細胞周期的影響 流式細胞儀檢測細胞周期,轉(zhuǎn)染72小時后收獲細胞,control siRNA組與空白對照組較轉(zhuǎn)染前無明顯差異,AMFR-siRNA組G0/G1期細胞比例增加,S期細胞比例明顯下降,而G2/M期無明顯差異。細胞周期蛋白CyclinDl mRNA表達水平也明顯降低AMFR-siRNA組為0.63±0.13,control siRNA組為1.01±0.11(t=6.565,p＜0.001)。5AMFR-siRNA對THP-1細胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染72小時后,AMFR-siRNA組凋亡細胞占(19.58±4.29%),而空白對照組及陰性對照組凋亡細胞分別為(4.01±1.52)%、(3.88±1.43)%,實驗組凋亡明顯增加(p＜0.001)。AMFR-siRNA組Bcl-2mRNA表達水平0.67±0.15較control siRNA組0.99±0.06下調(diào)(t=6.129,p＜0.001)。 結(jié)論 本實驗首次在兒童急性白血病骨髓原代細胞水平及細胞株水平證實了AMFR基因存在異常高表達,可能與急性白血病的發(fā)生、發(fā)展及預后不良有關(guān)。特異性AMFR-siRNA可以促進THP-1細胞凋亡,并阻止細胞的增殖。AMFR可能是急性髓細胞白血病基因治療的潛在靶點。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R733.71

【參考文獻】

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本文編號：2413063