【摘要】：嬰幼兒血管瘤（Infantile hemangiomas，IH）是嬰幼兒最常見(jiàn)的軟組織腫瘤，高加索人種發(fā)病率在4-12%之間，亞洲人種發(fā)病率在1%左右，女?huà)胂鄬?duì)高發(fā)，男女比例為1：3-4，早產(chǎn)低體重兒發(fā)病率明顯升高。嬰幼兒血管瘤一般在出生后數(shù)天或數(shù)周內(nèi)即進(jìn)入增生期表現(xiàn)為瘤體快速增殖，持續(xù)數(shù)周或數(shù)月后轉(zhuǎn)入平臺(tái)期，隨后進(jìn)入數(shù)年緩慢自發(fā)性的消退期，這種自然病程是IH的重要特征。雖然多數(shù)患兒的瘤體能夠消退完全，但多留有疤痕或脂肪沉積樣改變，增生早期對(duì)瘤體的控制能夠減少殘留面積，，同時(shí)約60%的IH瘤體發(fā)生于具有重要美學(xué)和生理功能的面頸部，以及仍有約20%的嬰幼兒血管瘤因其顯著的生長(zhǎng)性，或者侵犯、影響正常生理功能甚至威脅嬰幼兒生命而需要臨床及時(shí)治療，因尚無(wú)法預(yù)判患兒瘤體發(fā)展是否存在風(fēng)險(xiǎn)并需要特殊治療，故IH的早期干預(yù)治療越來(lái)越受到重視。但I(xiàn)H的具體發(fā)病機(jī)制仍然不明，臨床治療帶有一定的盲目性，因此IH的機(jī)制研究成為必要。目前的研究?jī)A向于IH來(lái)源于嬰幼兒血管瘤干細(xì)胞，具有未分化性表面標(biāo)記物的不成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量增殖，是嬰幼兒血管瘤增殖期快速生長(zhǎng)的關(guān)鍵原因。多項(xiàng)研究表明VEGFR2信號(hào)通路的高活性狀態(tài)對(duì)IH增生期的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移中起到了關(guān)鍵的作用，而NF-kB信號(hào)通路，Notch信號(hào)通路對(duì)IH的影響與VEGF信號(hào)通路活性的增強(qiáng)有密切的聯(lián)系，臨床廣泛使用的糖皮質(zhì)激素和普萘洛兒治療IH的機(jī)制研究也與VEGF信號(hào)通路活性密切相關(guān)。IH臨床表現(xiàn)為增生期、平臺(tái)期和消退期，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)平臺(tái)期是一種過(guò)度狀態(tài)，是IH瘤體主要增殖細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞逐漸停止增殖，并逐漸消失伴隨脂肪和纖維組織沉積的過(guò)度狀態(tài)。關(guān)于IH消退的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)凋亡在其中具有重要作用，同時(shí)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化和沉積可能也是消退的重要原因。但作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的重要調(diào)節(jié)因子microRNA在IH中的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此本課題旨在從microRNA在嬰幼兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用出發(fā)，對(duì)IH的病程發(fā)展機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，為更有效的指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。 本課題主要研究了以下內(nèi)容： 第一部分：不同時(shí)期嬰幼兒血管瘤組織差異microRNA的芯片檢測(cè)和篩選過(guò)Affymetrix miRNA3.0芯片對(duì)典型增生早期，平臺(tái)期和消退期3例IH標(biāo)本的microRNA進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)靶基因，在取兩者交集作為靶基因后，對(duì)基因進(jìn)行功能分析，篩選和IH相關(guān)功能基因構(gòu)建microRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對(duì)獲取的不同時(shí)期IH組織標(biāo)本共9例，增生早期4例，平臺(tái)期3例，消退期2例，抽提總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-130b-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-371a-5p，hsa-miR-373-3p，hsa-miR-455-5p莖環(huán)狀引物，采用SuperReal PreMix（SYBRGreen）試劑進(jìn)行realtimePCR實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以2-ΔΔCT進(jìn)行量化分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果三例標(biāo)本芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，差異倍數(shù)以3倍及以上作為差異microRNA入選標(biāo)準(zhǔn)，共獲得差異microRNA有38個(gè)，依疾病進(jìn)程下調(diào)的microRNA共22個(gè)，上調(diào)microRNA共16個(gè)。獲得這些差異microRNA的預(yù)測(cè)靶基因共2463個(gè)，基因功能GO-Analysis后，以IH疾病可能相關(guān)功能篩選得靶基因共540個(gè)，以此構(gòu)建的microRNA與基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的microRNA為：hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-130b-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-371a-5p，hsa-miR-373-3p，hsa-miR-455-5p。9例標(biāo)本抽提總RNA質(zhì)檢合格，各microRNA引物設(shè)計(jì)符合要求，realtimePCR結(jié)果顯示，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-455-5p組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，hsa-miR-130b-3p，hsa-miR-371a-5p，hsa-miR-373-3p組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 第二部分：嬰幼兒血管瘤來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 實(shí)驗(yàn)方法：獲取經(jīng)確診的IH增生早期手術(shù)后標(biāo)本，消毒處理后第一時(shí)間于4℃條件下以分散酶作用24h，去除表皮碎化組織后以膠原酶于37℃下作用40min，隨后進(jìn)行細(xì)胞過(guò)濾，過(guò)濾后單細(xì)胞懸液以CD31偶聯(lián)磁珠結(jié)合后經(jīng)磁珠分選儀分選。分選后細(xì)胞以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為對(duì)照，進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定，細(xì)胞吞脂實(shí)驗(yàn)、血管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)、CD31和vWF抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：IH血管內(nèi)皮細(xì)胞分選條件良好，可獲得較充分的細(xì)胞量，分選后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖能力自培養(yǎng)第三天后較人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增長(zhǎng)更快；細(xì)胞吞脂實(shí)驗(yàn)顯示與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)明顯差異；成管實(shí)驗(yàn)顯示與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞比較，IH來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞具備更快的成管能力，但成管較為雜亂；細(xì)胞免疫熒光染色顯示IH來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31和vWF抗體陽(yáng)性，所培養(yǎng)細(xì)胞陽(yáng)性率在92±3%。 第三部分：hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-455-5p對(duì)嬰幼兒血管瘤來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究 實(shí)驗(yàn)方法：以fam熒光標(biāo)記miR-67為轉(zhuǎn)染對(duì)照，單純轉(zhuǎn)染試劑為陰性對(duì)照，通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑將hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-455-5p的mimics或inhibitor轉(zhuǎn)染入IH來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)cck-8法檢測(cè)細(xì)胞活性反映細(xì)胞增殖能力改變，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平改變，transwell侵襲系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力改變，研究轉(zhuǎn)染前后目的microRNA對(duì)IH來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡與侵襲能力的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：fam熒光標(biāo)記miR-67顯示轉(zhuǎn)染條件良好，轉(zhuǎn)染效率近100%；和對(duì)照組比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-29a-3p的mimics后48h增殖能力無(wú)明顯改變，轉(zhuǎn)染后48h出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染24h后侵襲能力無(wú)明顯改變，細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-29a-3p的inhibitor后48h細(xì)胞增殖凋亡與侵襲能力無(wú)明顯改變；和對(duì)照組比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-206的mimics后48h增殖能力明顯減弱，轉(zhuǎn)染后48h出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染24h后侵襲能力明顯減弱，細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-206的inhibitor后增殖與細(xì)胞凋亡無(wú)明顯改變，細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)；和對(duì)照組比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-455-5p的mimics和inhibitor后48h增殖能力無(wú)明顯改變，轉(zhuǎn)染后48h無(wú)明顯細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染24h后侵襲能力無(wú)明顯改變。 本課題研究結(jié)論miR-29a-3p，miR-206，miR-455-5p在IH不同時(shí)期的microRNA表達(dá)譜中存在差異，這些差異miRNA可能參與了IH病程進(jìn)展多種相關(guān)功能調(diào)節(jié)； miR-29a-3p可能通過(guò)改變IH血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡水平影響疾病進(jìn)程，特別是對(duì)IH的自發(fā)消退起到了重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用；miR-206可能通過(guò)改變IH血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力、凋亡水平和侵襲能力影響IH病程發(fā)展變化，在IH自發(fā)消退過(guò)程中可能起到了重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。通過(guò)磁珠分選技術(shù)可獲得較高純度的IH來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R732.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 廖洪躍;邢新;歐陽(yáng)天祥;郭伶俐;李軍輝;薛春雨;袁斯明;李鳴;;組織塊結(jié)合酶消化法培養(yǎng)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年02期

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本文編號(hào)：2311499