【摘要】：官內(nèi)生長遲緩(IUGR)是指宮內(nèi)不良環(huán)境引起胎兒出生體重低于相應(yīng)孕周胎兒平均體重第10百分位數(shù)或平均體重兩個標(biāo)準(zhǔn)差。官內(nèi)不良環(huán)境可以影響胎兒發(fā)育,引起IUGR。而且,大量的流行病學(xué)和實驗室研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)那些存活的IUGR患兒與成年期發(fā)生的疾病如2型糖尿病、心血管疾病等密切相關(guān)并可以遺傳至下一代,這類疾病目前被稱為是“胎兒起源的成人疾病”。表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)和調(diào)控的可遺傳修飾。屬于表觀調(diào)控機(jī)制之一的微小RNA(miRNA)作為RNA干擾的主要執(zhí)行者,與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體結(jié)合,然后和靶mRNA3'UTRs序列特異性互補,調(diào)節(jié)基因表達(dá),導(dǎo)致翻譯抑制或使mRNA失去穩(wěn)定性。 近期已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),IUGR致成年期發(fā)生慢性缺氧性肺動脈高壓(CH-PAH)敏感性增高。但目前大部份表觀遺傳學(xué)證據(jù)的靶點是內(nèi)皮途徑調(diào)控肺動脈高壓,研究PASMCs上Kv通道的相關(guān)表觀調(diào)控機(jī)制證據(jù)較少。現(xiàn)有研究表明,和心血管肌細(xì)胞重構(gòu)密切相關(guān)的是miRNA-1家族。miRNA-1家族包括miRNA-1, miRNA-206和miRNA-133a/b。目前miRNA-1家族能否直接調(diào)控Kv通道表達(dá)及其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。 基于上述機(jī)理,本課題以官內(nèi)生長遲緩新生鼠為模型,成年期給予2周常壓缺氧,繼而篩選PASMCs上發(fā)生病理性改變的相關(guān)Kv通道,研究其在IUGR相關(guān)肺動脈高壓中可能存在的作用,并通過高通量芯片篩選參與調(diào)節(jié)的相關(guān)miRNA,探討miRNA在Kv通道調(diào)節(jié)IUGR相關(guān)的肺動脈高壓中的作用,深入闡明RNA干擾參與此生物學(xué)反應(yīng)的過程及其機(jī)制。 第一部分Kv1.5介導(dǎo)IUGR誘導(dǎo)大鼠成年期低氧性肺動脈高壓的研究 目的： 1.觀察IUGR大鼠缺氧后肺血管病理學(xué)改變,監(jiān)測肺循環(huán)血流動力學(xué)改變。 2.觀察IUGR誘導(dǎo)的缺氧性肺動脈高壓大鼠模型中相關(guān)Kv通道表達(dá)和功能的改變。 3.建立大鼠原代PASMCs,觀察缺氧的不同時間點,平滑肌細(xì)胞的增殖情況以及相關(guān)Kv通道亞型的表達(dá)和功能變化,評估Kv通道和細(xì)胞增殖的關(guān)系。 方法： 1.動物模型的建立和分組： IUGR及其缺氧組：全孕期給予母鼠正常飲食50%的量,直至產(chǎn)下IUGR仔鼠,仔鼠生長至12周給予2周低氧。 Control及其缺氧組：全孕期給予母鼠自由飲食直至產(chǎn)下正常仔鼠,仔鼠生長至12周給予2周低氧。 2.模型的評估：測量缺氧2周后右心室收縮壓,并用a-SMA免疫組化染色觀察肺血管的肌化程度,western blot檢測a-SMA在肺動脈中的表達(dá)豐度,測量右心室與左心室加室間隔的比值[ratio of right ventricle to left ventricle plus septum, RV/(LV+S)]評價右心室肥厚情況。 3.應(yīng)用鉀通道阻斷劑4-氨基吡啶(4-AP),四乙胺(TEA)和BaCl2比較阻力肺動脈對各種離子通道阻斷劑的收縮性。 4.用酶消化法分離大鼠的PASMCs,采用膜片鉗測定4-AP作用前后全細(xì)胞電流、膜電阻。 5. Western blot法檢測Kv通道蛋白在肺動脈平滑肌組織的表達(dá)情況。 6.建立PASMCs原代培養(yǎng),鑒定并行MTT試驗。免疫熒光染色法檢測Kv通道相關(guān)亞型在PASMCs表達(dá)情況。 7.過表達(dá)Kv通道相關(guān)亞型,觀察PASMCs增殖改變。 結(jié)果： 1. Control組大鼠右心室平均收縮壓(RVSP)22.88±0.38mmHg, IUGR組RVSP為23.76±0.28mmHg,兩組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。缺氧處理后,兩組RVSP明顯增加,而且IUGR-hypoxia組較Control-hypoxia組顯著升高,肺動脈平滑肌層顯著增厚,a-SMA表達(dá)顯著增加,右心指數(shù)顯著增大。 2.微血管張力測定發(fā)現(xiàn),4-AP引起明顯的血管收縮,BaCl2引起微弱的血管收縮,TEA基本不引起血管收縮。缺氧后,4-AP引起的收縮明顯減弱,且IUGR-hypoxia組弱于Control-hypoxia組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.缺氧后,IUGR-hypoxia組肺微小動脈平滑肌層Kv1.5表達(dá)低于Control-hypoxia組,Kv1.2、Kv2.1、Kv3.1及Kv9.3蛋白水平無明顯差異,PASMC單細(xì)胞Kv電流顯著低于Control-hypoxia組,各組膜電阻無明顯差異。 4.細(xì)胞形狀及a-SMA免疫熒光鑒定,95%以上為平滑肌細(xì)胞。 5. KCNA5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PASMCs后過表達(dá)Kv1.5, MTT試驗檢測細(xì)胞增殖水平,IUGR-hypoxia組各時間點OD值與Control-hypoxia組無明顯差異,Kv1.5表達(dá)及全細(xì)胞Kv電流無明顯差異。轉(zhuǎn)染前,IUGR-hypoxia組48小時OD值顯著高于Control-hypoxia組。 結(jié)論： 1.證實IUGR大鼠成年期遭遇低氧發(fā)生更嚴(yán)重的肺動脈高壓,阻力肺動脈病理性重構(gòu)加重。 2. IUGR大鼠成年期發(fā)生嚴(yán)重的缺氧性肺動脈高壓與PASMCs Kvl.5通道蛋白的表達(dá)和功能改變密切相關(guān)。 3.Kv1.5通道蛋白的表達(dá)升高可以抑制缺氧引起IUGR大鼠原代肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的效應(yīng)。 第二部分miRNA-206調(diào)控IUGR大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞對低氧反應(yīng)性的研究 目的： 1.從整體動物水平篩選并驗證IUGR大鼠成年期發(fā)生缺氧性肺動脈高壓的關(guān)鍵miRNA亞型。 2.在細(xì)胞水平觀察]miRNA-206的改變引起的Kv1.5蛋白表達(dá)變化以及細(xì)胞增殖能力的變化,評價miRNA-206和上述指標(biāo)之間的關(guān)系。 方法： 1. miRNA3.0芯片檢測肺動脈平滑肌組織miRNA表達(dá)情況,結(jié)合數(shù)據(jù)庫預(yù)測,篩選與IUGR大鼠成年期發(fā)生低氧性肺微小動脈重構(gòu)的miRNA亞型。 2.擴(kuò)大樣本,實時熒光定量PCR結(jié)合探針技術(shù)驗證缺氧前后miRNA亞型篩選結(jié)果。 3.在第一部分建立的原代PASMCs基礎(chǔ)上,用CoCl2建立細(xì)胞缺氧模型,用miRNA mimic干預(yù)細(xì)胞。 4. western blot法檢測Kv1.5蛋白表達(dá)情況,EdU試驗檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)。 結(jié)果： 1. miRNA3.0芯片檢測結(jié)果顯示,IUGR組和Control組相比,肺動脈平滑肌組織中miRNA-184和miRNA-206增長倍數(shù)高于≥2.0,且q值≤0.05。 2. TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測軟件分析KCNA5是miRNA-206的靶基因之一。 3. western blot檢測發(fā)現(xiàn),應(yīng)用miRNA-206mimic后,control-hypoxia組PASMCs Kvl.5蛋白表達(dá)量下降至IUGR-hypoxia組水平,兩組相比無明顯差異。 4.EdU試驗發(fā)現(xiàn),應(yīng)用miRNA-206mimic后, control-hypoxia組細(xì)胞增殖較轉(zhuǎn)染前加快,control-hypoxia組與IUGR-hypoxia組相比無明顯差異。 結(jié)論： 1.miRNA-206是參與調(diào)節(jié)IUGR大鼠成年期發(fā)生低氧性肺肺動脈高壓的關(guān)鍵分子之一。 2.miRNA-206通過調(diào)節(jié)缺氧對Kv1.5蛋白表達(dá)的抑制作用,影響PASMCs細(xì)胞增殖狀態(tài)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R722.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2296987