【摘要】：自2005年瑞典科學(xué)家Allander等人首次在呼吸道感染患兒的鼻咽吸出物中發(fā)現(xiàn)人博卡病毒(Human bocavirus, HBoV)以來,又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了3個新的HBoV基因型別—HBoV2～4。這些病毒屬于細小病毒科(Parvoridae)細小病毒亞科(Parvovirinae)的博卡病毒屬(Bocavirus),是迄今發(fā)現(xiàn)的繼細小病毒B19之后能感染人的第二類細小病毒。HBoV在世界各地均有報道,許多國家已經(jīng)報道了在不同標本中(如呼吸道標本、糞便、血清等)檢測出HBoVs,旦絕大部分的研究是針對HBoV1,對HBoV2～4的研究報道還很有限。從現(xiàn)有的資料來看,越來越多的臨床證據(jù)支持HBoVl為下呼吸道感染的致病病毒,而HBoV2～4主要在腹瀉患兒的糞便標本中檢出,這些感染腸道的HBoVs尤其是HBoV2在糞便標本中的檢出率要高于其它基因型別,提示它們可能與兒童的急性胃腸炎有關(guān)。目前為止,HBoV尚不能體外培養(yǎng),也無動物模型建立,阻礙了其復(fù)制機制及致病機理的研究。為揭示其復(fù)制機制,有研究在臨床標本中檢測了HBoV1、3的頭-尾DNA序列和環(huán)狀游離體結(jié)構(gòu),并在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了HBoV1的感染性克隆,以繞開上述瓶頸進行致病機理的研究。鑒于腹瀉病在我國兒童疾病譜中的重要地位,本研究對HBoV2進行了初步研究,以明確其與小兒腹瀉病的可能相關(guān)性；得到了HBoV2包括頭-尾序列在內(nèi)的完整基因組,這是國際上的首次報道；并嘗試構(gòu)建HBoV2的感染性克隆,為闡明這一病毒的復(fù)制模式和致病機制打下基礎(chǔ)。 首先,為了了解北京地區(qū)急性腹瀉患兒中HBoV2的流行情況并了解這一病毒的基因組特征,收集了2010年11月至2012年10月到首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院門診就診的急性腹瀉患兒的糞便標本1068例,應(yīng)用針對HBoV2NS1基因的PCR引物進行熒光實時PCR檢測。選擇2例病毒載量較高的陽性標本進行HBoV2各基因片段的擴增并測序。將所測到的序列進行拼接后得到接近完整的HBoV2基因組序列并與GenBank中的相關(guān)序列進行比較分析。結(jié)果顯示,所檢測的2010年11月至2012年10月期間的1068例糞便標本中有24例HBoV2DNA檢測陽性,陽性檢出率為2.2%；各年齡組中,3-6月齡患兒中的HBoV2DNA陽性檢出率最高,達3.6%(9/252),其次為6-9月齡(2.5%,5/203)的患兒,小于3月齡和大于3歲(含3歲)的患兒中未檢測到HBoV2陽性標本；所檢第一年度中,HBoV2日性檢出率在7月最高,為7.0%(3/43),其次為9月(4.8%,2/41)和6月(4.8%,2/42),1-4月無陽性標本檢出。第二年度中,HBoV2陽性檢出率在9月最高,為4.5%(2/44),其次為7月(4.5%,2/45),11、12月及1-5月無陽性標本檢出。24例HBoV2檢測陽性的患兒除1例患兒年齡大于2歲以外,其余均為2歲以下兒童。其中5例患兒同時合并有諾如病毒感染、5例合并有輪狀病毒感染、1例合并有腺病毒感染。經(jīng)測序得到兩株接近完整的HBoV2基因組序列BJQ19和BJQ390,長度分別為5273bp和5275bp；序列分析顯示這兩株序列的同源性為99.2%,與GenBank中來自中國上海的FJ375129株同源性最高,分別為99.1%和99.2%,為典型的HBoV2。上述結(jié)果表明,北京地區(qū)部分兒童的急性腹瀉可能與HBoV2感染相關(guān),且HBoV2感染在低年齡組腹瀉兒童中更為常見。 其次,為了明確HBoV2基因組是否存在頭-尾相接的環(huán)狀游離體結(jié)構(gòu),進一步對已確證為HBoV2(?)日性的24例急性腹瀉患兒的糞便標本進行了頭尾序列的測定。第一年度,通過巢式PCR檢測發(fā)現(xiàn)2例標本有預(yù)期目的條帶,經(jīng)測序證實其中1例(BJQ435)為HBoV2頭-尾序列陽性標本,隨后對各個片段進行擴增和測序得到了HBoV2完整的環(huán)狀基因組,標記為HBoV2-C1(GenBank序列號為JX257046)。第二年度,檢出2例HBoV2頭-尾序列陽性標本(Q1032和Q1089)并經(jīng)測序證實。HBoV2-C1全長含5307個核苷酸,含4個開放讀碼框(Open Reading Frame, ORF)依次含1923、648、2004、1617個核苷酸,分別編碼NS1、NP1、VP1(?)口VP2蛋白。基因組兩端即在VP1/VP2和NS1基因之間有520個核苷酸長度的非編碼區(qū)(Non-coding region, NCR),在HBoV2-C1末端連接頭尾的序列中有約50個核苷酸是在以往報告的HBoV末端序列中未發(fā)現(xiàn)過的,是本研究的新發(fā)現(xiàn)。對BoV2-C1和HBoV3-E1(JN086998)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,與HBoV3-E1相比,HBoV2-C1的“發(fā)卡結(jié)構(gòu)2”更為復(fù)雜,其帶有一個額外的兔耳樣結(jié)構(gòu)；另外一個主要的不同是,HBoV2-C15'末端結(jié)構(gòu)中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)比文獻報道的HBoV3-E1的分布更為分散。上述結(jié)果表明HBoV2基因組存在含頭-尾序列的環(huán)狀結(jié)構(gòu),這一發(fā)現(xiàn)對于這一病毒的復(fù)制機制補充了新的資料。 最后,在得到HBoV2環(huán)狀基因組的基礎(chǔ)上,進行了HBoV2全基因組重組質(zhì)粒的構(gòu)建。構(gòu)建策略如下：①將基因組插入到適當(dāng)?shù)妮d體中,利用限制性內(nèi)切酶將基因組切割下來,經(jīng)凝膠電泳純化后在體外使之自我環(huán)化,獲得環(huán)狀基因組。②設(shè)計含合適酶切位點的引物,利用擴增片段兩端的酶切位點和載體自身的酶切位點,將其基因組分段依次插入到同一載體。將整個基因組分為4個片段進行擴增,其中采用重疊延伸PCR擴增得到了含頭-尾序列的第四個片段HBoV2-4,并將各個片段插入到pGEM-T Easy載體得到了各個片段的重組質(zhì)粒,然后通過酶切、連接反應(yīng)及重疊延伸PCR擴增的方法將其余3個片段(HBoV2-1, HBoV2-2, HBoV2-3)拼接在一起,得到了含HBoV2-1+2+3片段的重組質(zhì)粒。HBoV2-1+2+3和HBoV2-4經(jīng)測序證實為HBoV2序列。全基因組的重組質(zhì)粒仍在構(gòu)建當(dāng)中。 綜上所述,本研究進行了北京地區(qū)急性腹瀉患兒中HBoV2的流行情況的初步調(diào)查并對這一病毒的基因組特征進行了分析；完成了HBoV2完整的基因組序列的測定分析,報道了HBoV2基因組存在頭-尾相接的環(huán)狀結(jié)構(gòu),這是國際上的首次報道；并在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了HBoV2-1+2+3片段和HBoV2-4片段的重組質(zhì)粒。上述研究結(jié)果為進一步深入研究HBoV2與兒童腹瀉的關(guān)系及其致病機理打下了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R725.1

【參考文獻】

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1 瞿小旺;漆正宇;段招軍;劉勁松;劉巧突;劉文培;黃燦平;謝志萍;彭夫望;高寒春;鄭麗舒;侯云德;;兒童急性呼吸道博卡病毒感染[J];病毒學(xué)報;2006年02期

2 羅健;劉恩梅;鄧昱;魏金鳳;徐文飛;陳杰華;王莉佳;劉瑋;楊錫強;符州;;重慶兒童醫(yī)院112例毛細支氣管炎病原分布特征分析[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2010年20期

3 嚴華杰;盛軍;董蔚;管麗華;王蔚;王凱;任培君;邵潔;;上海嘉定地區(qū)連續(xù)3年兒童人博卡病毒感染的研究[J];臨床兒科雜志;2010年06期

4 肖霓光;張兵;段招軍;謝志萍;鐘禮立;高寒春;丁小芳;李嘉;宋靖榮;劉震宇;黃寒;侯云德;;長沙地區(qū)急性下呼吸道感染住院兒童人博卡病毒感染的初步研究[J];臨床兒科雜志;2011年06期

5 孫紅;王斌;孫敏;劉瑜;朱軍生;楊繼紅;;免疫膠體金法與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測兒童腹瀉A組輪狀病毒[J];檢驗醫(yī)學(xué);2006年06期

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本文編號：2267311