本文選題：α7 + nAChR膽堿能通路��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：一、研究背景與目的新生兒敗血癥和腦膜炎(neonatal sepsis and meningitis, NSM)是新生兒期感染性疾病中最常見和最嚴重的疾病,其發(fā)病率和死亡率均較高,尤其在早產(chǎn)及低出生體重、極低出生體重嬰兒中發(fā)病率更高。30%的存活患兒伴有永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,諸如耳聾、癲癇、智力和運動障礙等。新生兒腦膜炎大多由菌血癥或敗血癥引起,其致病菌隨著抗生素的廣泛應(yīng)用不斷發(fā)生變化,近年來表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)成為美國醫(yī)院內(nèi)獲得性感染最常見的細菌,而中國仍以大腸桿菌(多具有K1抗原,Escherichia coli K 1, E.coli K 1)和葡萄球菌(staphylococcus)為主。E.coli K1株是引發(fā)NSM最常見的革蘭陰性桿菌,占革蘭陰性敗血癥的50%-60%甚至更高。E.coli K1主要來自母親的產(chǎn)道或直腸,據(jù)報道40%的無腦膜炎新生兒敗血癥血液或80%新生兒腦膜炎的腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中都可分離到該菌。孕婦因其特殊體質(zhì),腸道定植的E.coli K 1株容易易位于陰道,致使新生兒在通過產(chǎn)道時獲得感染。E.coli K1株一旦定植于新生兒腸道,0.5%可發(fā)生腸道侵襲性定位轉(zhuǎn)移而入血到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nevous system, CNS)血管,接著在該處形成局部血栓釋放出細菌栓子并穿過血腦屏障(blood brain barrier, BBB)而引發(fā)腦膜炎。細菌性敗血癥與腦膜炎(bacterial sepsis and meningitis, BSM)的三聯(lián)特征包括：1)致病菌侵襲；2) NF-κB激活；3)中性粒細胞(polymorphonuclear,PMN)遷移穿透主要由內(nèi)皮細胞組成的血腦屏障(BBB)。盡管抗生素是治療細菌性感染疾病的一類重要藥物,臨床上也有不少針對細菌的抗生素和相關(guān)的支持療法,但隨著時間的推移,病原微生物已對現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生了明顯的耐藥性。在過去幾十年,耐藥性大腸桿菌不斷增多,致使新生兒感染包括敗血癥和腦膜炎病死率和嚴重的CNS后遺癥居高不下,抗生素耐藥性問題日益嚴重地威脅著人類的健康。傳統(tǒng)抗生素的抗菌機制是通過與病原微生物體特定部位的受體結(jié)合,使病原微生物體的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞或使某些生物合成受阻,從而達到抑制或殺滅病原菌的作用。然而,當其作用的靶位點發(fā)生改變時,抗生素就會失去抗菌的作用,這是細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的一個主要原因。此外,抗菌素無法識別有害和有益的生物體,在殺死病菌的同時也會破壞體內(nèi)益生菌,使體內(nèi)益生菌減少,從而使體內(nèi)菌群失去平衡。因此,尋找通過宿主相關(guān)受體調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)而不是直接作用于致病菌達到清除體內(nèi)病原微生物的目的來治療微生物感染的抗感染藥物逐漸成為研究的熱點。這種宿主直接干預對抗病原體的方法可能在有效地阻斷病原菌感染的同時,降低病原微生物產(chǎn)生耐藥性的可能性,將突破傳統(tǒng)單純針對病原微生物的抗感染治療瓶頸。目前,治療BSM面臨的最主要的問題,就是缺乏針對上述三聯(lián)特征的有效的治療干預措施。我們前期研究發(fā)現(xiàn)a7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor, a7 nAChR)是神經(jīng)遞質(zhì)介導的離子通道受體,是一種關(guān)鍵的炎癥調(diào)節(jié)因子,在E.coli K 1株入侵宿主,PMN遷移穿越BBB和新生兒神經(jīng)炎癥即細菌性腦膜炎的三聯(lián)特征中起著至關(guān)重要的作用。a7 nAChR激動劑尼古丁(Nicotine, NT)能顯著激活BSM的三聯(lián)特征,而使用a7 nAChR抑制劑甲基牛扁堿(methyllycaconitine, MLA)或基因敲除技術(shù)阻斷a7 nAChR可顯著抑制BSM的三聯(lián)特征表現(xiàn)。因此宿主受體a7 nAChR有望成為獨特的治療BSM的藥物靶點。鹽酸美金剛(memantine hydrochloride, MEM)是一種FDA批準的用于治療中、重度阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的藥物,同時也是宿主受體α7 nAChR非競爭性抑制劑。已有研究顯示,MEM能影響大鼠或健康受試者的認知；在大鼠海馬神經(jīng)元中,MEM抑制α7 nAChR的效果(ICso=0.34μM)顯著高于NMDAR(IC50=5.1μM),這表明MEM的治療作用與宿主α7 nAChR密切相關(guān)。另外,有研究顯示,阻斷宿主α7 nAChR表達可明顯降低MEM對AD的療效,激活α7 nAChR對成年人有保護的作用,但對新生小鼠卻有損害的作用,這與我們的先前研究結(jié)果相一致。目前,隨著國內(nèi)外研究的深入,MEM已廣泛地應(yīng)用于臨床并嘗試用于多種其他疾病的治療。這種藥物重新定位的方法與傳統(tǒng)的藥物相比,不僅能降低成本、風險及上市時間,還可以理想地滿足治療罕見疾病的需求。這往往是開發(fā)傳統(tǒng)的常見病治療藥物所忽視的。在本研究中,我們采用藥物重新定位的方法,利用BBB的體內(nèi)外模型系統(tǒng),檢測MEM是否可用作直接針對宿主的抗微生物制劑來對抗BSM的三聯(lián)特征。新生兒由于免疫系統(tǒng)不健全、體內(nèi)屏障系統(tǒng)包括BBB發(fā)育尚未成熟,加之缺乏特異性免疫抗體,極易引發(fā)細菌性腦膜炎。大部分新生兒BSM是細菌血源性傳播的結(jié)果。大腸桿菌進入血液循環(huán)后定植引起菌血癥或敗血癥,經(jīng)血流播散穿越BBB進入CNS后到達腦脊液,是大腸桿菌性腦膜炎的重要發(fā)病機制。因此,抑制血液循環(huán)中致病菌的繁殖是治療BSM的關(guān)鍵。據(jù)此,本研究亦探討MEM的具體抑菌和殺菌機制。PMN是一類重要的吞噬細胞,其抑菌殺菌機制是通過細胞內(nèi)機制實現(xiàn)的,包括吞噬、滅活、消化等。同時,星形膠質(zhì)細胞(Astrocyte Cells)是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣泛的一類神經(jīng)膠質(zhì)細胞,具有吞噬功能。為了探討MEM的殺菌和治療BSM的具體機制,我們重點研究MEM對PMN和星形膠質(zhì)細胞吞噬病原菌的影響及其作用機制。MEM是否能提高PMN和星形膠質(zhì)細胞的吞噬及殺菌功能,MEM的殺菌機制與宿主受體α7 nAChR的關(guān)系等都是本研究希望探索的內(nèi)容。細胞生物學中關(guān)于中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)的系列研究進展為我們研究MEM在血液循環(huán)系統(tǒng)中的殺菌機制提供了新的思路。除了通過吞噬作用殺死病原菌外,激活的PMN還會通過奇特的程序性死亡(programmed cell death)釋放核內(nèi)的核苷酸、殺菌酶(如髓過氧化物酶,myeloperoxidase, MPO)和殺菌蛋白(S100A9),在胞外形成一張網(wǎng)絡(luò),即NETs,將入侵的細菌捕獲消滅。MEM在提高PMN吞噬功能的同時能否誘導NETs的形成而參與捕殺細菌的過程也是本文希望探討的內(nèi)容,從而更好地闡述MEM治療BSM的具體作用機制,為臨床應(yīng)用打下堅固的基礎(chǔ)。圍繞以上線索,本文主要開展以下幾方面的研究：(1)利用體外細胞模型探討MEM的藥物靶向性；分析比較n-甲基-d-天冬氨酸受體(n-methyl-D-aspartate receptors, NMDARs)和α7 nAChR抑制劑MEM對抑制致病菌E44入侵宿主的異同；使用siRNA技術(shù)下調(diào)CHRNA7基因表達后檢測MEM對致病菌E44入侵HBMEC的影響,確定MEM是否通過抑制宿主α7 nAChR來阻斷NT增強致病菌E44穿透BBB的能力；(2)通過體外細菌的侵襲實驗和體內(nèi)新生小鼠BSM模型探討MEM對致病菌入侵組織屏障的影響；(3)利用體內(nèi)外模型系統(tǒng)檢測MEM對相關(guān)炎癥通路和腦損傷的影響；(4)探討MEM防治細菌性敗血癥和腦膜炎的作用機制；通過PMN的吞噬殺菌實驗和免疫熒光實驗,體外分析MEM對PMN吞噬殺滅致病菌的影響；檢測宿主受體α7 nAChR和殺菌蛋白S100A9在其殺菌機制中的相互作用；采用NETs實驗試劑盒和免疫熒光的方法分析檢測MEM對NETs形成的影響,進一步確定MEM的具體殺菌機制；(5)體外HBMEC細胞模型系統(tǒng)和體內(nèi)血源性新生小鼠BSM模型系統(tǒng)檢測MEM與抗生素的聯(lián)合應(yīng)用防治BSM的效果。二、研究方法與結(jié)果1、MEM的藥物靶向性研究1)檢測MEM的藥物靶向性及其作用靶點,明確MEM的殺菌功能是否與宿主α7 nAChR有關(guān)。HBMEC與NT作用48 h后,加入不同劑量的MEM進行處理并進行細菌的侵襲實驗。結(jié)果顯示,與對照組相比,MEM可明顯阻斷NT增強E44侵襲的效果,并呈劑量依賴性；當NT的使用劑量為10μM時,50μM MEM處理組中E44的相對侵襲率為35%(P0.05)。2)為了明確MEM的作用靶點,比較分析NMDARs和α7nAChR激動劑和阻斷劑對胞內(nèi)致病菌E44存活的影響的異同。在細菌的侵襲實驗中分別加入不同劑量的NMDARs和α7 nAChR激動劑(NT和NMD A)以及α7 nAChR阻斷劑MEM、兩種NMDARs抑制劑犬尿素(kynurenic acid, Kyn)和右美沙芬(dextromethorphan, DM)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與MEM處理組相比,Kyn和DM并不能抑制胞內(nèi)細菌的存活。與此同時,我們還發(fā)現(xiàn),與α7 nAChR激動劑NT相同處理劑量(10μM)的NMDA并不能明顯提高細菌E44侵襲HBMEC的能力。3)為了進一步證明MEM的殺菌功能與宿主α7 nAChR有關(guān),我們使用siRNA技術(shù)下調(diào)CHRNA7基因在HBMEC中的表達。HBMEC分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒α7 nAChR siRNA和scrambled siRNA, Western Blot顯示HBMEC細胞中CHRNA7基因的下調(diào)效果達80%左右。與對照組相比,CHRNA7基因下調(diào)后,NT誘導的增強E44侵襲HBMEC的效果明顯被阻斷(P0.05),同時,MEM的抑菌效果明顯減弱,MEM對E44的半數(shù)抑制量ICso大大提高,為25.57μM (P0.05)。4)為了確定MEM的藥物靶向,我們同時檢測MEM的體外抗菌活性,在體外培養(yǎng)E44的同時加入不同濃度的MEM,分別在37℃孵育1至8 h后檢測其吸光度(OD600)并繪制細菌生長曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEM并不影響E44的體外生長。不同劑量的MEM處理組的E44生長曲線與對照組無顯著差異。2、探討MEM對細菌入侵組織屏障的影響1)為了研究MEM對大腸桿菌感染的影響,我們首先檢測MEM對致病菌E44侵襲HBMEC的抑制效果。在腦膜炎致病菌E44感染HBMEC的不同時間點(感染前、感染同時和感染后)加以不同濃度的MEM進行干預處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEM在不同的時間加以處理均可明顯抑制細胞內(nèi)致病菌E44的存活率(P0.05),并呈劑量依賴性；其中MEM與細菌同時作用時效果最顯著(P0.001),當MEM使用濃度為50μM時,E44的相對侵襲率僅為10%左右。2)為了證實體外實驗中關(guān)于MEM的生物學功能,我們建立了新生小鼠BSM的體內(nèi)模型系統(tǒng)。首先檢測MEM是否可治療新生小鼠BSM,7-9日齡小鼠在大腸桿菌E44感染的同時腹腔注射給予不同劑量的MEM,感染18 h后,血樣本及腦脊液(CSF)樣本倍比稀釋后涂布LB平板計算菌落數(shù),結(jié)果顯示MEM處理組中新生小鼠血液和腦脊液中細菌存活量顯著降低(P0.05),菌血癥及腦膜炎感染率分別為14.4%和0；小鼠外周血中血腦屏障損傷細胞標志物cBMEC的數(shù)量明顯降低(P0.05)。3、探討MEM對炎癥通路及腦損傷的影響1)為了檢測MEM對炎癥反應(yīng)的影響,我們利用體外細胞模型系統(tǒng)檢測MEM對PMN遷移穿越血腦屏障的影響;HBMEC與NT作用48 h后,進行PMN的遷移實驗并加入不同劑量的MEM進行處理。結(jié)果顯示MEM可明顯抑制NT增強PMN遷移穿透HBMEC的效果,并呈劑量依賴性；與對照組相比,當NT的使用劑量為10μM時,50μM MEM處理組中E44的相對遷移率為38%(P0.05)。2)為了檢測MEM對體內(nèi)相關(guān)炎癥通路及腦損傷的影響,7-9日齡小鼠在大腸桿菌E44感染的同時腹腔注射給予MEM,感染18h后,提取CSF樣本進行分析。ELISA實驗結(jié)果顯示,MEM處理組小鼠CSF中炎癥因子MMP 9和p65的表達量明顯減少(P0.05)。免疫組化實驗結(jié)果表明,與對照組相比,MEM治療后,細菌性感染新生小鼠腦損傷及老化程度明顯降低。4、MEM的殺菌機制研究1)我們前面研究顯示MEM可顯著降低新生小鼠BSM,為了進一步探討MEM的殺菌機制,我們通過PMN和星形膠質(zhì)細胞的吞噬及殺菌實驗檢測MEM對PMN和星形膠質(zhì)細胞吞噬及殺菌功能的影響。PMN和Astrocyte細胞與一定數(shù)量E44孵育的同時加以MEM處理1 h,存活細菌數(shù)量通過涂布平板計算菌落數(shù)。吞噬實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,MEM可顯著增強PMN和Astrocyte細胞的殺菌功能,當MEM的使用劑量為50gM時,與對照組相比,E44的相對存活率為38.5%和35%(P0.05)；不同MOI的PMN與帶有GFP標記的大腸桿菌K1株E44 (E44-GFP)孵育的同時與一定量的MEM(50μM)作用,熒光顯微鏡檢測E44-GFP被PMN吞噬的情況。結(jié)果顯示,加MEM處理后,PMN能吞噬更多的致病菌(P0.05),表明MEM能提高PMN的吞菌功能。2)前面研究顯示宿主α7 nAChR對MEM抑制E44侵襲和PMN遷移穿透BBB起著重要的作用。因此為了進一步探討MEM的具體殺菌機制及探索宿主受體α7nAChR與殺菌蛋白S100A9在其殺菌機制中的相互作用,我們采用siRNA技術(shù),沉默經(jīng)1.3% DMSO處理分化完全的HL60細胞(dHL60)中CHRNA7與S100A9基因的表達,Western Blot的方法檢測其下調(diào)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)dHL60中CHRNA7基因的表達后(下調(diào)效率達80%),S100A9基因的表達明顯降低(P0.05)；而S100A9基因表達的降低對CHRNA7的表達沒有明顯影響。說明S100A9基因的表達受α7 nAChR的調(diào)控。已有研究表明,S100A9蛋白具有殺菌功能,通過PMN的吞菌實驗顯示,下調(diào)CHRNA7基因的表達后,致病菌E44的存活率顯著降低,與對照組相比,E44的相對存活率為55%(P0.05), MEM的殺菌功能被阻斷；而下調(diào)S100A9基因的表達后,致病菌E44的存活率顯著升高(P0.05)。3)我們采用免疫熒光技術(shù)的方法,PMN與MEM和E44共同孵育1 h后,與CHRNA7與S100A9抗體共同孵育過夜,免疫熒光顯微鏡觀察兩者之間的表達情況及相互作用。以非處理組中PMN的CHRNA7與S100A9的表達為對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn),加E44刺激后,α7 nAChR和S100A9蛋白在細胞邊緣及細胞核周圍的表達升高,α7 nAChR與S100A9蛋白的結(jié)合作用明顯增強；經(jīng)軟件Image J分析發(fā)現(xiàn)兩者高度結(jié)合(R接近1)；然而加MEM處理后,這種相互結(jié)合作用明顯降低。4)已有研究顯示,PMN除了吞噬功能之外,中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)的形成釋放核內(nèi)的核苷酸、殺菌酶(如髓過氧化物酶,myeloperoxidase, MPO)和殺菌蛋白(S100A9)等能捕殺病原體,我們的研究也證明MEM有助于PMN吞噬殺菌。因此我們推想MEM是否能誘導NETs的形成而參與捕殺細菌的過程。在本研究中,分離正常人外周血PMN后,我們采用NETs試劑盒的方法定量分析MEM和E44刺激PMN后對誘導NETs形成的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEM能刺激PMN相關(guān)彈性蛋白酶和殺菌蛋白的釋放,NETs含量增加,表明MEM參與誘導NETs的形成。另外,采用免疫熒光染色方法評價NETs生成情況。與對照組相比,MEM體外刺激PMN4h后產(chǎn)生大量胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(NETs),該結(jié)構(gòu)還包含DNA,殺菌蛋白如鈣調(diào)蛋白S100A9和殺菌酶髓過氧化物酶(MPO)等成分。5、探討MEM與抗生素的聯(lián)合治療新生小鼠BSM的效果為進一步闡述MEM能防治新生兒細菌性敗血癥和腦膜炎,解決抗生素的細菌耐藥性問題,我們通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)MEM和抗生素Amp聯(lián)合使用的抑菌效果明顯高于單獨使用(P0.05),并具有協(xié)同作用(CI1)。7-9日齡小鼠感染致病菌E446 h后腹腔注射MEM和Amp治療14 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組的細菌感染率明顯降低(P0.05)。三、統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標準差(Mean±SD)。兩組間的比較采用t檢驗(student's ttest),多重比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。動物實驗陽性率的比較采用Pearson卡方檢驗。P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,檢驗水準為a=0.05。數(shù)據(jù)分析和圖表制作采用軟件SPSS 13.0和GraphPad Prism 5.0。四、結(jié)論MEM能阻斷BSM的三聯(lián)特征包括：1)致病菌入侵；2)NF-κB激活；3)PMN遷移穿透BBB,從而達到治療新生兒BSM的目的。在BSM前期,即菌血癥或敗血癥期,我們推測MEM的殺菌作用機制可能是通過抑制α7 nAChR,解聚PMN中E44介導的中高度聚合的α7 nAChR和S100A9蛋白,釋放部分S100A9并結(jié)合MEM誘導形成的NETs中的其他殺菌蛋白酶(MPO)、核酸DNA、殺菌肽(如,LL-37)等提高抗菌活性,并通過其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)捕獲并殺滅細菌,從而抑制E44在血液中繁殖,達到預防腦膜炎的目的。在BSM后期,即腦膜炎期,我們推測MEM的殺菌作用機制可能是通過阻斷BSM的三聯(lián)特征,增強神經(jīng)膠質(zhì)細胞的吞噬殺菌功能,從而修復致病菌所致BBB損傷,減輕炎癥反應(yīng)和腦損傷達到治療腦膜炎的目的,但其具體機制有待進一步研究。同時,MEM能聯(lián)合抗生素協(xié)同防治新生小鼠BSM,這種通過直接干預宿主受體對抗病原體的方法可以在有效地阻斷病原菌感染的同時,降低病原微生物產(chǎn)生耐藥性的可能性,將突破傳統(tǒng)單純針對病原微生物的抗感染治療瓶頸。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R722.13

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本文編號：2048643