發(fā)布時間：2018-05-29 06:22

  本文選題：mRNA + miRNA�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分miRNA-mRNA芯片聯(lián)合篩選肛門直腸畸形的致病基因目的:檢測肛門直腸畸形(Anorectal Malformations,ARMs)患者直腸末端組織中的miRNA表達(dá)譜、mRNA表達(dá)譜,利用生物信息學(xué)方法對結(jié)果進(jìn)行分析,初步探討肛門直腸畸形的發(fā)生發(fā)展的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。方法:選取我院2013年5月至10月診斷為ARMs的患兒直腸盲端組織標(biāo)本7例作為實驗組,其中男5例,女2例,中高位閉鎖4例,低位3例,另取3例尸檢嬰兒(死于非腸道疾病)直腸末端標(biāo)本作正常對照。Trizol法提取總RNA并檢測質(zhì)量,運(yùn)用miRNA、mRNA芯片進(jìn)行分別檢測,篩選三組差異表達(dá)的miRNA、mRNA,對差異基因及miRNA做趨勢分析,篩選得到顯著性的基因表達(dá)趨勢,對差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測,并與篩選得到的差異基因取交集,得到交集基因1,對交集基因1進(jìn)行Gene Ontology基因功能及生物學(xué)通路富集分析,利用Cytoscape軟件整合KEGG、HPRD、BIOGRID、INTACT、MINT等數(shù)據(jù)庫對顯著性差異的GO及Pathway條目下的所包含的基因進(jìn)行相互作用分析,找出其中的關(guān)鍵調(diào)控基因。選取其中4個采用實時定量PCR驗證,運(yùn)用單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果:通過將對照組、低位組、高位組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,篩選出8011個差異基因及88個差異micro RNA。mRNA顯著性趨勢有4個,miRNA顯著性趨勢有2個,miRNA靶基因預(yù)測后與mRNA取負(fù)交集共得到差異基因2705個。對差異基因進(jìn)行GO富集分析,顯著性差異的GO條目為轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程、胚胎形成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、肌細(xì)胞分化等;對KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要位于腫瘤相關(guān)信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、EB病毒感染、細(xì)胞骨架調(diào)控、鈣離子信號傳導(dǎo)、腫瘤調(diào)控等通路。將顯著差異GO及Pathway條目下的基因進(jìn)行基因、基因產(chǎn)物相互作用分析,得到的Signal-Net網(wǎng)絡(luò)分析其中的核心基因,包括MAPK1、FGFR2、EP300、SRC、PLCB1、CDC42、MLLT4、TJP1等,根據(jù)micro RNA和靶基因之間調(diào)控關(guān)系,構(gòu)建micro RNA-Gene-Network,關(guān)鍵micro RNA包括has-miR-124-3p、has-miR-29c-3p、has-miR-1185-2-3p、has-miR-103a-3p、has-miR-4795-3p等,選取基因MAPK1、FGFR2、EP300進(jìn)行Real-Time PCR驗證,均具有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:運(yùn)用miRNA-mRNA芯片結(jié)合生物信息學(xué)工具對ARMs發(fā)生相關(guān)的差異基因進(jìn)行深入分析,最終篩選到與該病發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因,證明基因網(wǎng)絡(luò)在肛門直腸畸形的的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用,篩選的差異基因可能成為今后研究ARMs的新方向。第二部分維生素A及其相關(guān)基因在肛門直腸畸形發(fā)病中的作用研究目的:檢測血清維生素A水平、組織中維生素A相關(guān)受體表達(dá)水平、與維生素A相關(guān)的新基因HA117及其相鄰的DPF3基因表達(dá)水平與先天性肛門直腸畸形患兒發(fā)病的關(guān)系,探討維生素A在肛門直腸畸形發(fā)病中的作用。方法:1、隨機(jī)選取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院胃腸、新生兒外科2012年5月至2013年9月診斷為ARMs的患兒35例,其中男22例,女13例,年齡1天—8月23天,其中低位閉鎖11例,中位閉鎖12例,高位閉鎖12例,收集術(shù)后切除患兒直腸盲端組織作為實驗組;另取7例尸檢嬰兒(死于非腸道疾病)直腸末端組織標(biāo)本作為對照組。Trizol法提取總RNA,采用實時熒光定量PCR方法分別檢測實驗組與對照組組織標(biāo)本中的HA117、DPF3b、RARα、RARβ、RARγ的表達(dá)量,提取組織蛋白,運(yùn)用western-blot方法檢測實驗組與對照組組織標(biāo)本中DPF3b、RARα、RARβ蛋白表達(dá)水平2、第一次入院時抽取35例患兒靜脈血2ml,收集上清;另收集10例正常新生兒血清作為對照組,采用高相液相色譜法對兩組血清標(biāo)本vit A水平進(jìn)行檢測3、采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間比較采用單因素方差分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1、Q-PCR結(jié)果顯示,肛門直腸畸形患兒直腸盲端組織中RARα表達(dá)量較對照組明顯降低(P0.01),RARα表達(dá)量隨盲端位置升高而表達(dá)降低;RARβ在中高位、低位ARMs與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);RARγ在ARMs各類型組織中表達(dá)與對照組未見明顯差異(P0.05),HA117表達(dá)量中高位組、低位組較對照組均有明顯差異(P0.01),三組表達(dá)量依次下降;DPF3b與HA117相反,三組表達(dá)依次增高;2、western-blot檢測DPF3b、RARα、RARβ蛋白表達(dá)水平,DPF3b在對照組、低位組、中高位組依次降低,組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01);RARα在中高位組表達(dá)明顯下降,低位組表達(dá)較對照組也降低(P0.05);RARβ在中高位組、低位組表達(dá)與對照組無明顯差異;3、實驗組中高位、低位患兒血清維生素A水平較對照組明顯降低(P0.01),分別為0.37±0.11,0.38±0.14,0.90±0.09μmol/L,按病理類型分組,中高、低位ARMs組間患兒血清Vit A水平未見明顯差異(P0.05)。結(jié)論:維生素A及其受體在胚胎期腸道發(fā)育中至關(guān)重要,維生素A缺乏可能是引起肛門直腸畸形發(fā)病原因之一。新發(fā)現(xiàn)的維生素A相關(guān)基因HA117可能通過與DPF3負(fù)調(diào)控參與了其發(fā)病過程。第三部分以慢病毒為載體跨胎盤RNAi RARα基因構(gòu)建腸道畸形小鼠的實驗研究目的:應(yīng)用慢病毒載體,采用跨胎盤RNA干擾技術(shù)干擾胚胎鼠RARα基因表達(dá),實驗探索基因部分下調(diào)小鼠的高效技術(shù),并觀察干擾RARα基因后的小鼠腸道發(fā)育情況。方法:構(gòu)建維生素A特異性受體基因RARα干擾慢病毒,將重組干擾慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎來源的間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2,通過RT-PCR、Western-blot方法驗證其對RARα基因的干擾效果;通過尾靜脈向孕期9天時母鼠分別注射RARα-RNAi慢病毒載體、空載病毒載體及Ringer’s液。注射96小時后處死部分孕鼠,取出胚胎觀測胚胎變化,體視熒光儀檢測胚胎熒光表達(dá)情況,并采用Western blotting及RT PCR檢測RARα、Sonic hedgehog(Shh)、HA117的表達(dá)情況;剩余孕鼠自然分娩后觀察子代鼠腸道發(fā)育情況,采用適當(dāng)指標(biāo)對腸道發(fā)育情況進(jìn)行評價。結(jié)果:1)RARα-RNAi慢病毒載體及LV-vector空病毒可以成功感染C3H10T1/2,干擾有效;2)動物實驗中,尾靜脈注射病毒96小時后體式熒光可以檢測到熒光,注射108Tu/只病毒量較其他注射量明顯(P0.05);3)RARα-RNAi組胚胎RARα基因mRNA及蛋白表達(dá)較空載組、Ringer’s對照組明顯下調(diào)(P0.01);4)Ringer’s組、空載對照組胚胎及新生鼠中未見明顯發(fā)育異常,RARα-RNAi胚胎及新生鼠中發(fā)現(xiàn)肛門閉鎖、四肢及脊柱發(fā)育異常、頭面部發(fā)育異常等畸形鼠;5)RARα-RNAi組小鼠腸道組織與其他組比較,發(fā)育遲緩,肌層較薄,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育不良,RARα、Shh、HA117表達(dá)水平低(P0.01)。結(jié)論:采用慢病毒作為載體實現(xiàn)跨胎盤RNA干擾,方法可行、干擾有效,可實現(xiàn)干擾動物體內(nèi)基因部分表達(dá)的效果,構(gòu)建基因下調(diào)模型動物;RARα基因在胚胎發(fā)育中起到重要作用,部分干擾RARα基因可導(dǎo)致小鼠腸道發(fā)育畸形及其他畸形,其機(jī)制可能是通過RARα/Shh信號通路實現(xiàn)。第四部分采用二代測序技術(shù)探討相關(guān)基因在ARMs發(fā)生中的作用目的:采用第二代測序技術(shù)探討基因RARα、RARβ、HA117、DPF3、MAPK1、FOXO3、Shh、EP300、FGFR2在肛門直腸畸形中的作用,對這些基因進(jìn)行突變篩查。方法:收集我院50例2013年5月至2014年12月診斷為ARMs患兒血液標(biāo)本,提取外周血全基因組DNA,設(shè)計針對RARα、RARβ、HA117、DPF3、MAPK1、FOXO3、Shh、EP300、FGFR2外顯子區(qū)域的特異性探針,利用多重PCR擴(kuò)增的方法對引物進(jìn)行多重擴(kuò)增,并采用Hiseq2500進(jìn)行測序,使用SOAPsnp及GATK軟件分析樣本SNP及突變信息,通過數(shù)據(jù)庫比對及分析,確定突變位點。結(jié)果:設(shè)計合成的目標(biāo)基因特異性捕獲探針可有效地富集基因組DNA的外顯子區(qū)域。在50個樣本中共發(fā)現(xiàn)31個突變位點,其中錯義突變15個,無義突變16個。與亞洲人這些突變位點發(fā)生率進(jìn)行比對,有10個差別較大的位點,其中7個為錯義突變,且全部位于Fox O3基因上。7個位點中的3個為新發(fā)現(xiàn)突變,分別為c1582 T(29)G、c 874 C(29)T、c1088 T(29)A,有5個可以導(dǎo)致氨基酸疏水性改變,包括rs199833934/rs9635679、rs201947198/rs9635700、c 1241 T(29)A、c1088T(29)A、c 874 C(29)T。結(jié)論:多重擴(kuò)增測序技術(shù)能夠發(fā)掘ARMs發(fā)病相關(guān)的新突變,該方法快速有效。Fox O3上的突變位點可能與ARMs的發(fā)病密切相關(guān),Fox O3可以作為研究ARMs的新方向。
[Abstract]:In order to find out the key regulatory genes involved in the diagnosis of anorectal malformation ( ARMs ) , we screened out 8011 differential genes and 88 differentially expressed micro RNAs by using the method of bioinformatics . The effects of vitamin A and its related genes on the pathogenesis of anorectal malformation were studied . The expression levels of RAR偽and RAR偽were significantly lower than those in the control group ( P0.05 ) . The results showed that the expression of RAR偽was significantly lower than that in the control group ( P0.05 ) . 3,瀹為獙緇勪腑楂樹綅,浣庝綅鎮(zhèn)ｅ効琛，

本文編號：1949828