本文選題：腸道病毒71型 + 人腸道上皮細胞　； 參考：《南京大學》2016年博士論文

【摘要】：腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是單股正鏈RNA病毒,是引起嬰幼兒手足口病的主要病原體。從1969年在美國Califonia分離出來至今,EV71在全世界已有很多次爆發(fā)流行,但大規(guī)模流行主要集中在亞太地區(qū)。大部分病例為自限性疾病,常表現(xiàn)為手足口部位的皰疹,重癥患兒常伴有腦膜腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣急性遲緩性麻痹、腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥,部分患者因肺出血、肺水腫而死亡。至今為止,臨床上還沒有有效的抗病毒藥物,對EV71感染的患者目前主要以對癥和支持治療為主。干擾素(Interferon, IFN)是天然免疫的第一道防線,通過誘導無數(shù)抗病毒蛋白(interferon-stimulated genes, ISGs)的產(chǎn)生,發(fā)揮其抗病毒作用。由于IFN的抗病毒作用的影響,病毒逐漸進化出各種抵抗IFN的抗病毒作用的機制。一般來說,病毒是通過抑制干擾素的產(chǎn)生或阻斷干擾素的反應來拮抗干擾素的抗病毒作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn),EV71不僅可以抑制IFN的產(chǎn)生,并且能夠抑制外源性IFN的作用。但具體機制尚不清楚,需要進一步研究。人腸道上皮是EV71的起始復制點,但EV71感染的患兒卻少有腸道癥狀,提示在腸道存在特異性的免疫反應。但這方面研究缺乏相關(guān)報道。我們前期研究結(jié)果顯示,EV71感染人橫紋肌肉瘤細胞(Rhabdomyosarcoma cell,RD)及人宮頸癌上皮細胞(Human cervical carcinoma cell line, HeLa)后,宿主細胞只能產(chǎn)生極低水平的IFN-p,而EV71感染腸道細胞(Human colorectal adenocarcinoma HT-29)后,能誘導大量的IFN-β的產(chǎn)生。不同細胞對EV71反應的差異的具體機制不清,需進一步研究。本研究應用real-time PCR的方法檢測感染EV71的RD. HeLa和HT-29細胞中各種IFNs的表達。結(jié)果顯示,與RD和HeLa細胞相比,在EV71感染的HT-29細胞中,不僅IFN-p,其他Ⅰ型IFN (IFN-α、-ε、-κ和-ε)、Ⅱ型IFN (IFN-γ)以及Ⅲ型IFN (IFN-λ1、-λ2和-λ3)的表達都明顯的升高。IFN的產(chǎn)生主要由RLR和TLR這兩條信號通路介導。通過應用免疫印跡的方法對比這兩條信號通路的主要蛋白的表達情況,我們觀察到,一方面,在RD、HeLa和HT-29細胞中,EV71感染明顯下調(diào)RIG-I樣受體(retinoic-acid-inducible gene I-like receptors, RLR)信號通路的重要信號分子線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS),說明三種細胞中,RLR信號通路都受到明顯抑制,區(qū)別不大；而另一方面,在RD和HeLa細胞中,EV71感染顯著地誘導Toll樣受體信號通路的重要信號分子p干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-p, TRIF)的降解,而在HT-29細胞中TRIF并沒有被EV71降解。我們進一步研究TRIF在RD或HeLa細胞被降解的原因,免疫熒光和免疫印跡的實驗結(jié)果顯示,過表達3C能夠切割RD細胞中TRIF蛋白,但對HT-29細胞中的TRIF蛋白的表達沒有影響。應用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建敲低TRIF基因的HT-29細胞,然后用EV71感染敲低TRIF的HT-29細胞和正常表達TRIF的HT-29細胞,觀察其宿主抗病毒反應。結(jié)果顯示,與正常表達TRIF的HT-29細胞相比,EV71明顯抑制敲除TRIF的HT-29細胞的IFN的產(chǎn)生。收集細胞上清,應用TCID50的方法檢測病毒滴度。實驗結(jié)果顯示,敲除TRIF的HT-29細胞上清中的病毒滴度明顯高于正常表達TRIF的HT-29細胞上清的病毒滴度。以上結(jié)果說明EV71主要通過TLR-TRIF信號通路誘導HT-29細胞產(chǎn)生IFN,從而抑制病毒感染,而這一通路在腸道上皮細胞沒有被完全抑制。本研究揭示了EV71在腸道細胞中能夠誘導特殊的抗病毒宿主免疫反應的機制,不同于在RD或HeLa細胞,可能是感染后腸道癥狀輕微的原因之一。干擾素通過JAK-STAT信號通路發(fā)揮抗病毒作用。我們針對EV71感染與JAK-STAT信號通路的相互作用過程進行了研究。盡管幾十年來,IFN作為一種有效的抗病毒藥物用于臨床治療各種病毒感染,如人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒,但是對EV71感染的患兒并沒有明顯效果。EV71可能通過某種機制抑制外源性IFN的作用。然而目前關(guān)于EV71抑制IFN作用的機制仍存在爭議。有部分學者認為,EV71的2A蛋白通過誘導干擾素的受體(IFN-Alpha/Beta Receptor 1, IFNAR1)的降解,抑制IFN的信號傳導。而另有部分學者的研究表明,EV71感染對IFNAR1的蛋白水平并沒有影響,而是通過降低Janus激酶1(Janus kinase 1, JAK1)的蛋白水平,抑制JAK-STAT信號通路,從而阻斷IFN的作用。本研究中,我們通過在IFN預處理過的細胞感染EV71病毒,采用結(jié)晶紫染色法和TCID50的實驗結(jié)果顯示,用IFN預處理細胞既不能抑制EV71感染造成的細胞病變效應,也不能抑制病毒的復制和釋放。另外,免疫印跡的實驗結(jié)果顯示,大劑量的EV71感染,對IFNAR1、JAK1和信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription 1/2, STAT1/STAT2)的蛋白水平均沒有明顯的影響。結(jié)果因而提示,EV71感染對于干擾素的不敏感可能通過其它機制介導。進一步通過核漿分離實驗和免疫熒光實驗我們發(fā)現(xiàn),EV71感染并不抑制IFN誘導的STAT1/2的磷酸化,但是卻阻斷了p-STAT1/2的核轉(zhuǎn)位。采用免疫共沉淀實驗我們發(fā)現(xiàn),EV71能夠抑制核轉(zhuǎn)運蛋白A1(karyopherin α1, KPNA1)和STAT1的相互作用；而KPNA1作為核定位信號蛋白,參與蛋白的核質(zhì)轉(zhuǎn)移過程,其對于p-STAT1的入核是必不可少的。提取EV71感染的蛋白,用免疫印跡的方法檢測KPNA1蛋白的表達,我們發(fā)現(xiàn)EV71感染可以誘導KPNA1蛋白的降解。蛋白質(zhì)的降解可通過病毒蛋白酶的水解作用,或是由細胞內(nèi)的蛋白降解途徑介導。而細胞內(nèi)蛋白的降解途徑主要有三個：1)泛素蛋白酶體途徑；2)自噬溶酶體途徑；3)胱天蛋白酶(caspase)介導的蛋白降解途徑。體外過表達EV712A和3C蛋白并不能酶解KPNA1,說明KPNA1的降解和病毒蛋白的蛋白酶活性無關(guān)。應用caspase光譜抑制劑、自噬抑制劑以及溶酶體抑制劑處理細胞,發(fā)現(xiàn)只有在應用caspase廣譜抑制劑的情況下,才能夠逆轉(zhuǎn)EV71感染對PNA1的下調(diào)作用。進一步應用caspase-3、caspase-4、caspase-6和caspase-8的特異性抑制劑前處理細胞。結(jié)果表明,只有在應用caspase-3特異性抑制劑的前提下,才能夠逆轉(zhuǎn)EV71對KPNA1的降解作用,說明EV71誘導的KPNA1的降解是由caspase-3介導的。此外,螢火蟲熒光素酶實驗和realtime PCR的結(jié)果顯示,過表達2A和3C蛋白既不影響ISRE的活性,也不影響IFN誘導的ISGs的產(chǎn)生。另外,通過免疫熒光實驗和核質(zhì)分離實驗我們觀察到,EV71感染抑制IFN誘導的干擾素調(diào)節(jié)因子9(interferon regulatory factor, IRF9)的核轉(zhuǎn)位以及STAT2和IRF9蛋白的表達,但不影響STAT1的表達；應用轉(zhuǎn)染的方法同時過表達STAT2和IRF9,也能夠逆轉(zhuǎn)EV71對IFN誘導的ISGs的抑制作用。綜上所述,本研究首先闡明了EV71感染,在腸道HT-29細胞中抗病毒天然免疫得以誘導的機制,即通過TLR/TRIF信號通路介導HT-29細胞產(chǎn)生IFN,而這一機制在RD和HeLa細胞中由于TRIF被降解而被有效抑制。本研究還試圖闡明EV71抑制IFN作用的新機制：EV71一方面通過活化caspase-3誘導KPNA1的降解,從而抑制p-STATl的核轉(zhuǎn)位,阻斷IFN誘導的ISGs的產(chǎn)生；另一方面可以通過抑制IFN誘導的STAT2和IRF9的表達,從而抑制ISGs的持續(xù)高表達。以上研究結(jié)果將加深我們對EV71感染的致病機制和宿主防御機制的認識和理解,也為今后抗EV71病毒藥物的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Enterovirus 71 ( EV71 ) is a single strand of positive strand RNA virus , which is the main pathogen of infantile hand - foot disease . In recent years , EV71 has been mainly concentrated in the Asia - Pacific region . Compared with RD and HeLa cells , the expression of IFN - p , IFN - 偽 , IFN - 緯 , IFN - 緯 and IFN - 位1 , - 位2 and - 位3 in HeLa and HT - 29 cells were significantly increased .
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本文編號：1887943