本文選題：促食素 + 中樞性性早熟　； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的研究促食素(Orexin-A)對(duì)中樞性性早熟(CPP)大鼠性發(fā)育進(jìn)程的影響,觀察Orexin-A干預(yù)后CPP大鼠下丘腦中母源性表達(dá)的基因3(MEG3)及吻肽(Kisspeptin)的表達(dá),分析Orexin-A、MEG3及Kisspeptin表達(dá)之間的潛在關(guān)系,探討Orexin-A影響CPP的機(jī)制。對(duì)象與方法1.大鼠性早熟模型的建立及動(dòng)物分組5日齡雌性SD大鼠48只,隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(Group 1),早熟模型組(Group 2),早熟模型+生理鹽水組(Group 3),早熟模型+Orexin-A組(Group 4),每組12只。適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天后,模型組大鼠每只皮下注射所配制的300 μg達(dá)那唑溶液以建立性早熟模型,正常對(duì)照組每只皮下注射等體積的生理鹽水。對(duì)第4組大鼠,在15日齡時(shí)側(cè)腦注射0.5 nmol/L Orexin-A,一天一次,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。第3組大鼠側(cè)腦注射等體積生理鹽水。當(dāng)大鼠達(dá)到20日齡時(shí),觀察大鼠陰門(mén)開(kāi)口情況,并記錄大鼠陰門(mén)開(kāi)口日。自陰門(mén)開(kāi)口日起,記錄20天陰門(mén)開(kāi)口情況。將每組大鼠進(jìn)一步細(xì)分為青春期啟動(dòng)前階段、青春期啟動(dòng)階段及青春期啟動(dòng)后階段。分別在上述相應(yīng)的階段處死大鼠,取出大鼠卵巢和子宮樣本,根據(jù)器官指數(shù)=器官濕重/體重,計(jì)算卵巢指數(shù)與子宮指數(shù)。迅速分離的下丘腦組織液氮凍存。2.Western blot 法將液氮中保存的下丘腦組織取出碾碎后,RIPA裂解組織,使用Bio-Rad蛋白分析試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。將所有提取出的蛋白質(zhì)用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離轉(zhuǎn)膜,測(cè)定MEG3及Kisspeptin蛋白水平。3.定量實(shí)時(shí)PCR法(qRT-PCR)使用RNeasy試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量法檢測(cè)下丘腦MEG3和Kisspeptin mRNA的表達(dá)水平。4.染色體免疫沉淀分析(ChIP試驗(yàn))采用Chip試劑盒分析Kisspeptin啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白的乙�；癄顟B(tài),從而檢測(cè)大鼠下丘腦中乙酰化組蛋白H3和H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合能力。5.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染DMEM培養(yǎng)HT22細(xì)胞,保持細(xì)胞密度低于80%以防止細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。構(gòu)建pcDNA-MEG3 載體以過(guò)表達(dá) MEG3,使用 Lipofectamine 2000 將 pcDNA-MEG3 或 pcDNA,轉(zhuǎn)染至HT22細(xì)胞,qRT-PCR及Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Kisspeptin的mRNA水平和蛋白水平。ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白H3、H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合水平。結(jié)果1.Orexin-A延緩大鼠中樞性性早熟癥狀通過(guò)觀察大鼠陰道開(kāi)口時(shí)間以及2個(gè)規(guī)則的性周期發(fā)生時(shí)間,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組大鼠相比,第2組和第3組大鼠陰道開(kāi)口時(shí)間明顯較早。第4組大鼠與第3組相比,陰道開(kāi)口時(shí)間較晚。四組大鼠中性周期發(fā)生時(shí)間趨勢(shì)與此相同,Orexin-A推遲了性早熟大鼠性周期發(fā)生時(shí)間。在青春期階段,第2組和第3組大鼠的子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)均大于第1組大鼠的子宮指數(shù)和卵巢指數(shù),第4組大鼠的子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)較第3組小。以上結(jié)果表明,Orexin-A可延緩大鼠中樞性性早熟癥狀。2.Orexin-A抑制中樞性性早熟大鼠下丘腦中MEG3的表達(dá)利用熒光定量PCR檢測(cè)4組大鼠的下丘腦中MEG3水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),早熟模型大鼠與正常鼠相比,下丘腦中MEG3表達(dá)增加,而注射Orexin-A逆轉(zhuǎn)下丘腦中MEG3表達(dá)的變化3.Orexin-A抑制中樞性性早熟大鼠下丘腦中Kisspeptin的表達(dá)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)4組大鼠的下丘腦中Kisspeptin水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),早熟模型大鼠與正常鼠相比,下丘腦中Kisspeptin的表達(dá)增加,而注射Orexin-A逆轉(zhuǎn)下丘腦中Kisspeptin表達(dá)的變化。4.Orexin-A降低中樞性性早熟大鼠中乙�；M蛋白H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合利用ChIP試驗(yàn)檢測(cè)大鼠中乙�；M蛋白H3和H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合能力。結(jié)果示,四組大鼠下丘腦中乙�；M蛋白H3與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合能力無(wú)差異。早熟模型大鼠與正常鼠相比,下丘腦中乙�；M蛋白H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合增加,而注射Orexin-A逆轉(zhuǎn)下丘腦中這種結(jié)合的變化。5.體外細(xì)胞培養(yǎng),HT22細(xì)胞過(guò)表達(dá)MEG3時(shí)組蛋白H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合增強(qiáng),Kisspeptin表達(dá)增加為檢測(cè)MEG3對(duì)Kisspeptin的調(diào)控作用,HT22細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3以過(guò)表達(dá)MEG3。ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HT22細(xì)胞過(guò)表達(dá)MEG3,組蛋白H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合增加。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)MEG3時(shí)細(xì)胞中Kisspeptin表達(dá)增加。結(jié)論Orexin-A在大鼠中樞性性早熟中發(fā)揮重要作用,能抑制CPP大鼠的下丘腦-垂體-性腺軸的功能,延緩CPP進(jìn)程,降低Kisspeptin的表達(dá)。MEG3可能參與了 Orexin A抑制Kisspeptin的作用通路。
[Abstract]:Objective To study the effects of orexin - A on the developmental progression of central nervous prematurity ( CPP ) rats , and observe the potential relationship between orexin - A , MEG3 and Kisspeptin . The rats were divided into 4 groups : normal control group ( Group 1 ) , early puberty model group ( Group 2 ) , premature model + physiological saline group ( Group 3 ) , early puberty model + orexin - A group ( Group 4 ) . Results 1 . Orexin - A delayed the expression of MEG3 in the hypothalamus of rats . The results showed that the expression of histone H4 and Kisspeptin in the hypothalamus of rats were significantly higher than those in the normal control group .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R725.8

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本文編號(hào)：1785716