本文選題：促食素 + 中樞性性早熟�。� 參考：《揚州大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的研究促食素(Orexin-A)對中樞性性早熟(CPP)大鼠性發(fā)育進程的影響,觀察Orexin-A干預后CPP大鼠下丘腦中母源性表達的基因3(MEG3)及吻肽(Kisspeptin)的表達,分析Orexin-A、MEG3及Kisspeptin表達之間的潛在關系,探討Orexin-A影響CPP的機制。對象與方法1.大鼠性早熟模型的建立及動物分組5日齡雌性SD大鼠48只,隨機分為4組:正常對照組(Group 1),早熟模型組(Group 2),早熟模型+生理鹽水組(Group 3),早熟模型+Orexin-A組(Group 4),每組12只。適應性喂養(yǎng)兩天后,模型組大鼠每只皮下注射所配制的300 μg達那唑溶液以建立性早熟模型,正常對照組每只皮下注射等體積的生理鹽水。對第4組大鼠,在15日齡時側腦注射0.5 nmol/L Orexin-A,一天一次,直到實驗結束。第3組大鼠側腦注射等體積生理鹽水。當大鼠達到20日齡時,觀察大鼠陰門開口情況,并記錄大鼠陰門開口日。自陰門開口日起,記錄20天陰門開口情況。將每組大鼠進一步細分為青春期啟動前階段、青春期啟動階段及青春期啟動后階段。分別在上述相應的階段處死大鼠,取出大鼠卵巢和子宮樣本,根據器官指數=器官濕重/體重,計算卵巢指數與子宮指數。迅速分離的下丘腦組織液氮凍存。2.Western blot 法將液氮中保存的下丘腦組織取出碾碎后,RIPA裂解組織,使用Bio-Rad蛋白分析試劑盒測定總蛋白濃度。將所有提取出的蛋白質用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離轉膜,測定MEG3及Kisspeptin蛋白水平。3.定量實時PCR法(qRT-PCR)使用RNeasy試劑盒提取總RNA,逆轉錄為cDNA,熒光定量法檢測下丘腦MEG3和Kisspeptin mRNA的表達水平。4.染色體免疫沉淀分析(ChIP試驗)采用Chip試劑盒分析Kisspeptin啟動子區(qū)域組蛋白的乙酰化狀態(tài),從而檢測大鼠下丘腦中乙�；M蛋白H3和H4與Kisspeptin啟動子結合能力。5.細胞培養(yǎng)及轉染DMEM培養(yǎng)HT22細胞,保持細胞密度低于80%以防止細胞過度生長。構建pcDNA-MEG3 載體以過表達 MEG3,使用 Lipofectamine 2000 將 pcDNA-MEG3 或 pcDNA,轉染至HT22細胞,qRT-PCR及Western blot檢測實驗檢測Kisspeptin的mRNA水平和蛋白水平。ChIP實驗檢測蛋白H3、H4與Kisspeptin啟動子結合水平。結果1.Orexin-A延緩大鼠中樞性性早熟癥狀通過觀察大鼠陰道開口時間以及2個規(guī)則的性周期發(fā)生時間,結果發(fā)現,與正常對照組大鼠相比,第2組和第3組大鼠陰道開口時間明顯較早。第4組大鼠與第3組相比,陰道開口時間較晚。四組大鼠中性周期發(fā)生時間趨勢與此相同,Orexin-A推遲了性早熟大鼠性周期發(fā)生時間。在青春期階段,第2組和第3組大鼠的子宮指數和卵巢指數均大于第1組大鼠的子宮指數和卵巢指數,第4組大鼠的子宮指數和卵巢指數較第3組小。以上結果表明,Orexin-A可延緩大鼠中樞性性早熟癥狀。2.Orexin-A抑制中樞性性早熟大鼠下丘腦中MEG3的表達利用熒光定量PCR檢測4組大鼠的下丘腦中MEG3水平,結果發(fā)現,早熟模型大鼠與正常鼠相比,下丘腦中MEG3表達增加,而注射Orexin-A逆轉下丘腦中MEG3表達的變化3.Orexin-A抑制中樞性性早熟大鼠下丘腦中Kisspeptin的表達熒光定量PCR和Western blot檢測4組大鼠的下丘腦中Kisspeptin水平,結果發(fā)現,早熟模型大鼠與正常鼠相比,下丘腦中Kisspeptin的表達增加,而注射Orexin-A逆轉下丘腦中Kisspeptin表達的變化。4.Orexin-A降低中樞性性早熟大鼠中乙�；M蛋白H4與Kisspeptin啟動子結合利用ChIP試驗檢測大鼠中乙酰化組蛋白H3和H4與Kisspeptin啟動子結合能力。結果示,四組大鼠下丘腦中乙酰化組蛋白H3與Kisspeptin啟動子結合能力無差異。早熟模型大鼠與正常鼠相比,下丘腦中乙酰化組蛋白H4與Kisspeptin啟動子結合增加,而注射Orexin-A逆轉下丘腦中這種結合的變化。5.體外細胞培養(yǎng),HT22細胞過表達MEG3時組蛋白H4與Kisspeptin啟動子結合增強,Kisspeptin表達增加為檢測MEG3對Kisspeptin的調控作用,HT22細胞中轉染pcDNA-MEG3以過表達MEG3。ChIP實驗發(fā)現,HT22細胞過表達MEG3,組蛋白H4與Kisspeptin啟動子結合增加。熒光定量PCR和Western blot檢測發(fā)現,過表達MEG3時細胞中Kisspeptin表達增加。結論Orexin-A在大鼠中樞性性早熟中發(fā)揮重要作用,能抑制CPP大鼠的下丘腦-垂體-性腺軸的功能,延緩CPP進程,降低Kisspeptin的表達。MEG3可能參與了 Orexin A抑制Kisspeptin的作用通路。
[Abstract]:Objective To study the effects of orexin - A on the developmental progression of central nervous prematurity ( CPP ) rats , and observe the potential relationship between orexin - A , MEG3 and Kisspeptin . The rats were divided into 4 groups : normal control group ( Group 1 ) , early puberty model group ( Group 2 ) , premature model + physiological saline group ( Group 3 ) , early puberty model + orexin - A group ( Group 4 ) . Results 1 . Orexin - A delayed the expression of MEG3 in the hypothalamus of rats . The results showed that the expression of histone H4 and Kisspeptin in the hypothalamus of rats were significantly higher than those in the normal control group .

【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R725.8

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本文編號：1785716