發(fā)布時間：2018-04-13 21:46

  本文選題：孤獨癥 + 丙戊酸鹽��； 參考：《復旦大學》2012年博士論文

【摘要】：孤獨癥(autism)又稱自閉癥,是一種廣泛的神經發(fā)育障礙性疾病,一般于3歲前發(fā)病,嚴重影響兒童的語言形成、情緒認知與社會行為。多數患兒有明顯的語言交流艱難、社交行為障礙、重復刻板行為三大核心臨床表現(xiàn)。這些患兒不能正常入托、上學,甚至將來也無法工作。近年來的統(tǒng)計數據資料表明,autism的發(fā)病率逐年增多。Autism的病因不明,目前普遍認為是遺傳和環(huán)境因素在腦發(fā)育關鍵時期共同作用的結果。如,妊娠早期有丙戊酸鹽(Valproic acid, VPA)用藥史的產婦,其子代發(fā)生autism風險大大增加。非遺傳因素可能與干擾胚胎腦發(fā)育的正常的信號通路傳導有關,而遺傳因素可能是信號通路傳導異常導致的基因突變所致。 Wnt/β-catenin信號通路對個體發(fā)育,尤其是神經系統(tǒng)發(fā)育有重要的調控作用。在個體發(fā)育早期,它調控神經細胞的增殖、分化、凋亡與遷移以及突觸的形成與聯(lián)系,調控細胞、組織及器官正常有序的分化和生長發(fā)育。然而Wnt通路猶如雙刃劍,既是調控神經細胞正常分化發(fā)育的重要通路,又是神經發(fā)育疾病發(fā)生的成因之一,通路中任何蛋白分子的異常,都將引起信號傳遞錯誤,導致細胞命運的改變,進而引發(fā)神經發(fā)育障礙疾病的發(fā)生,如autism。許多autism患者存在Wnt2編碼序列基因突變,故Wnt2基因是autism易感基因。敲除通路中散亂蛋白(Dishevelled, Dvl)-1基因的小鼠,表現(xiàn)出社交行為和感覺運動障礙,說明Dvl-1基因可能參與動物社會行為的形成,這可能與Dvl-1調節(jié)神經發(fā)育有關,因為從Dvl-1敲除鼠組織培養(yǎng)的海馬神經元樹突發(fā)育異常。Dvl-1和Dvl-2缺失的小鼠,神經管閉合不全。β-catenin轉基因小鼠,則能使神經前體細胞增殖,導致巨大腦、腦皮質容量增加,這可能與autism腦早期的過度增生有關。這些研究強烈提示Wnt通路與autism的發(fā)病密切相關。 近年來,大量臨床資料報道表明autism患者存在氧化應激的失調,如氧化應激生物標記物分泌增加,體內內源性抗氧化能力減少,能量代謝失調,線粒體功能障礙。Dickkopfl (Dkkl)是一種分泌性的Wnt抑制劑。研究顯示,Dkk1轉染能顯著增加氧化應激產生的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平。Nucleoredoxin (NRX)作為一種氧化還原劑,通過與Dvl作用,對Wnt信號通路進行負調節(jié)。H202作用于細胞減少了NRX和Dvl的相互作用,導致T細胞因子(T cell factor, TCF)暫時激活。而與這些結果截然相反的許多研究顯示,H202誘導ROS依賴性的信號轉導抑制了β-catenin/TCF轉錄活性。ROS能抑制許多磷酸酶,而H202處理后GSK3怎么去磷酸化并不清楚。有趣的是,有研究顯示,Dv1高表達能改善H202誘導的β-catenin/TCF轉錄活性抑制。因此,這些研究提示ROS依賴于Dvl在調節(jié)Wnt信號通路中起雙重作用。這也說明氧化應激與Wnt信號通路之間存在關聯(lián)。 那么,autism動物模型是否存在氧化應激異常?在autism產生過程中氧化應激與Wnt信號通路是否存在關聯(lián)?用Wnt信號通路特異性抑制劑是否能改善autism行為學異常?目前尚不清楚。針對這些問題,本課題集中研究autism動物模型及培養(yǎng)神經元中氧化應激與Wnt/β-catenin通路相關分子的關系,以探討autism發(fā)病的相關分子機制。我們主要進行了以下三方面的工作： 一、建立并檢測了autism動物模型。采用Wistar大鼠,在妊娠第12.5天時,腹腔注射(Intraperitoneal injecting, ip) VPA制作子代autism大鼠模型,并運用熱板致痛法、傾斜板實驗、Morris水迷宮等方法對模型大鼠進行發(fā)育與行為學檢測。結果顯示,與正常對照組比較,autism模型組大鼠腦發(fā)育異常、睜眼時間推遲、方向趨向性機能及傷害性知覺下降、游泳能力差、重復刻板動作增加、學習記憶和空間探索能力差。這些表現(xiàn)與人類autism患者的某些特征極為相似,表明用VPA注射法較成功地制作出了autism大鼠模型。 二、研究了Wnt/β-catenin信號通路及氧化應激水平。運用Real-time PCR和Western blot技術檢測autism模型大鼠前額葉皮層(Prefrontal cortex, PFC)和海馬(Hippocampus, HC)兩腦區(qū)Wnt通路信號蛋白GSK-3p,磷酸化GSK-3β(Phosphorylated GSK-3β, P-GSK-3β), β-catenin,磷酸化β-catenin (Phosphorylated β-catenin, P-β-catenin)及氧化應激標記物4-羥壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE),硫氧還原蛋白(Thioredoxin, Trx)等相關分子的表達。進而我們檢測了Wnt信號通路的特異性抑制劑Sulindac對氧化應激的影響。Western Blot結果顯示,在autism模型大鼠PFC和HC腦區(qū),Wnt通路關鍵信號蛋白失活的P-GSK-3β上調,抑制性的P-β-catenin下調,差異顯著高于對照組(P0.001)。同時,氧化應激標記物4-HNE表達增加(P0.01),Trx表達減少(P0.05)。Real-time PCR結果顯示,autism模型組大鼠PFC和HC腦組織GSK-3βmRNA水平顯著低于對照組(P0.05),而β-catenin mRNA水平顯著高于對照組(P0.01)。同時,抗氧化基因trx1,trx2mRNA表達下調(P0.05)。Wnt信號通路的特異性抑制劑Sulindac作用以后,與autism模型大鼠相比,VPA+Sulindac處理組失活的P-GSK-3p下調(P0.05),抑制性的P-β-catenin上調(P0.05),而氧化應激標記物4-HNE減少(P0.05)。行為學研究結果顯示,與autism模型大鼠相比,Sulindac預處理,大鼠的痛閩相對正常；重復刻板動作減少；學習和記憶能力有所提高。以上結果表明,Wnt信號通路抑制劑Sulindac預處理,能削弱Wnt信號通路的亢進機能,從而減少氧化應激的發(fā)生,最終使autism模型鼠的異常行為獲得不同程度的改善。 三、采用細胞培養(yǎng)技術探討了Wnt/β-catenin通路與氧化應激在autism發(fā)生過程中的作用。應用Real-time PCR, Western blot及流式細胞分析(Flow analytical cytometry system, FACS)技術深入研究VPA處理的原代培養(yǎng)神經元Wnt/β-catenin與氧化應激的關系。Real-time PCR及Western blot結果顯示,在VPA處理培養(yǎng)神經元中,GSK-3βmRNA及蛋白表達顯著低于對照組,失活的P-GSK-3p顯著高于對照組；而P-catenin mRNA及蛋白表達顯著高于對照組,抑制性的P-β-catenin顯著低于對照組。同時,在VPA處理培養(yǎng)神經元中,4-HNE表達顯著高于對照組。FACS研究結果顯示,VPA處理組ROS表達水平顯著高于對照組。Sulindac處理以后,與VPA處理組相比,β-catenin蛋白表達下調,P-β-catenin表達上調,GSK-3p表達上調,P-GSK-3p表達下調,4-HNE下調。Real-time PCR結果顯示,抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)處理雖然減少了ROS的產生,但是并沒有改變GSK-3β mRNA和P-catenin mRNA的表達。以上結果揭示,Wnt/β-catenin通路活性增強導致氧化應激的產生,VPA促進神經元氧化應激的產生由于該通路上調所致。 綜上所述,我們的工作提示：環(huán)境因素(如VPA暴露)通過誘導腦組織Wnt/β-catenin通路活性改變,使腦內經典Wnt信號通路活性增強,進而增加氧化應激的產生、氧化穩(wěn)態(tài)的異常,有可能進一步影響神經元的正常發(fā)育和聯(lián)系,阻礙了正常的神經網絡形成,從而引起社會交往、情緒和語言等行為方面的異常,最終導致autism的發(fā)病。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R749.94

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 李瑞錫;江開達;彭裕文;;孤獨癥研究新進展[J];復旦學報(醫(yī)學版);2010年01期

2 王維霞;王月華;陳明軍;上野照子;小野武年;西條壽夫;李瑞錫;彭裕文;;PV陽性神經元在孤獨癥模型大鼠情緒與認知相關腦區(qū)內的表達[J];神經解剖學雜志;2008年02期

3 王月華;姚君茹;陳明軍;李瑞錫;彭裕文;;BDNF免疫反應陽性神經元在大鼠孤獨癥動物模型大腦頂葉感覺皮層中的表達[J];神經解剖學雜志;2008年03期

4 陳明軍;于劍鋒;柴繼俠;徐理;王中平;李瑞錫;彭裕文;;Wnt通路信號蛋白β-catenin和GSK-3β在孤獨癥模型大鼠腦中表達的變化[J];神經解剖學雜志;2009年04期

5 張建娜;兒童孤獨癥的診斷與治療現(xiàn)狀[J];中國醫(yī)刊;2005年04期

，

本文編號：1746322