本文選題：孤獨(dú)癥 + 丙戊酸鹽　； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：孤獨(dú)癥(autism)又稱自閉癥,是一種廣泛的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病,一般于3歲前發(fā)病,嚴(yán)重影響兒童的語言形成、情緒認(rèn)知與社會(huì)行為。多數(shù)患兒有明顯的語言交流艱難、社交行為障礙、重復(fù)刻板行為三大核心臨床表現(xiàn)。這些患兒不能正常入托、上學(xué),甚至將來也無法工作。近年來的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)資料表明,autism的發(fā)病率逐年增多。Autism的病因不明,目前普遍認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素在腦發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期共同作用的結(jié)果。如,妊娠早期有丙戊酸鹽(Valproic acid, VPA)用藥史的產(chǎn)婦,其子代發(fā)生autism風(fēng)險(xiǎn)大大增加。非遺傳因素可能與干擾胚胎腦發(fā)育的正常的信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān),而遺傳因素可能是信號(hào)通路傳導(dǎo)異常導(dǎo)致的基因突變所致。 Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)個(gè)體發(fā)育,尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要的調(diào)控作用。在個(gè)體發(fā)育早期,它調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡與遷移以及突觸的形成與聯(lián)系,調(diào)控細(xì)胞、組織及器官正常有序的分化和生長(zhǎng)發(fā)育。然而Wnt通路猶如雙刃劍,既是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞正常分化發(fā)育的重要通路,又是神經(jīng)發(fā)育疾病發(fā)生的成因之一,通路中任何蛋白分子的異常,都將引起信號(hào)傳遞錯(cuò)誤,導(dǎo)致細(xì)胞命運(yùn)的改變,進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的發(fā)生,如autism。許多autism患者存在Wnt2編碼序列基因突變,故Wnt2基因是autism易感基因。敲除通路中散亂蛋白(Dishevelled, Dvl)-1基因的小鼠,表現(xiàn)出社交行為和感覺運(yùn)動(dòng)障礙,說明Dvl-1基因可能參與動(dòng)物社會(huì)行為的形成,這可能與Dvl-1調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育有關(guān),因?yàn)閺腄vl-1敲除鼠組織培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育異常。Dvl-1和Dvl-2缺失的小鼠,神經(jīng)管閉合不全。β-catenin轉(zhuǎn)基因小鼠,則能使神經(jīng)前體細(xì)胞增殖,導(dǎo)致巨大腦、腦皮質(zhì)容量增加,這可能與autism腦早期的過度增生有關(guān)。這些研究強(qiáng)烈提示W(wǎng)nt通路與autism的發(fā)病密切相關(guān)。 近年來,大量臨床資料報(bào)道表明autism患者存在氧化應(yīng)激的失調(diào),如氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物分泌增加,體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化能力減少,能量代謝失調(diào),線粒體功能障礙。Dickkopfl (Dkkl)是一種分泌性的Wnt抑制劑。研究顯示,Dkk1轉(zhuǎn)染能顯著增加氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平。Nucleoredoxin (NRX)作為一種氧化還原劑,通過與Dvl作用,對(duì)Wnt信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。H202作用于細(xì)胞減少了NRX和Dvl的相互作用,導(dǎo)致T細(xì)胞因子(T cell factor, TCF)暫時(shí)激活。而與這些結(jié)果截然相反的許多研究顯示,H202誘導(dǎo)ROS依賴性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性。ROS能抑制許多磷酸酶,而H202處理后GSK3怎么去磷酸化并不清楚。有趣的是,有研究顯示,Dv1高表達(dá)能改善H202誘導(dǎo)的β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性抑制。因此,這些研究提示ROS依賴于Dvl在調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路中起雙重作用。這也說明氧化應(yīng)激與Wnt信號(hào)通路之間存在關(guān)聯(lián)。 那么,autism動(dòng)物模型是否存在氧化應(yīng)激異常?在autism產(chǎn)生過程中氧化應(yīng)激與Wnt信號(hào)通路是否存在關(guān)聯(lián)?用Wnt信號(hào)通路特異性抑制劑是否能改善autism行為學(xué)異常?目前尚不清楚。針對(duì)這些問題,本課題集中研究autism動(dòng)物模型及培養(yǎng)神經(jīng)元中氧化應(yīng)激與Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子的關(guān)系,以探討autism發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制。我們主要進(jìn)行了以下三方面的工作： 一、建立并檢測(cè)了autism動(dòng)物模型。采用Wistar大鼠,在妊娠第12.5天時(shí),腹腔注射(Intraperitoneal injecting, ip) VPA制作子代autism大鼠模型,并運(yùn)用熱板致痛法、傾斜板實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮等方法對(duì)模型大鼠進(jìn)行發(fā)育與行為學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,autism模型組大鼠腦發(fā)育異常、睜眼時(shí)間推遲、方向趨向性機(jī)能及傷害性知覺下降、游泳能力差、重復(fù)刻板動(dòng)作增加、學(xué)習(xí)記憶和空間探索能力差。這些表現(xiàn)與人類autism患者的某些特征極為相似,表明用VPA注射法較成功地制作出了autism大鼠模型。 二、研究了Wnt/β-catenin信號(hào)通路及氧化應(yīng)激水平。運(yùn)用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)autism模型大鼠前額葉皮層(Prefrontal cortex, PFC)和海馬(Hippocampus, HC)兩腦區(qū)Wnt通路信號(hào)蛋白GSK-3p,磷酸化GSK-3β(Phosphorylated GSK-3β, P-GSK-3β), β-catenin,磷酸化β-catenin (Phosphorylated β-catenin, P-β-catenin)及氧化應(yīng)激標(biāo)記物4-羥壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE),硫氧還原蛋白(Thioredoxin, Trx)等相關(guān)分子的表達(dá)。進(jìn)而我們檢測(cè)了Wnt信號(hào)通路的特異性抑制劑Sulindac對(duì)氧化應(yīng)激的影響。Western Blot結(jié)果顯示,在autism模型大鼠PFC和HC腦區(qū),Wnt通路關(guān)鍵信號(hào)蛋白失活的P-GSK-3β上調(diào),抑制性的P-β-catenin下調(diào),差異顯著高于對(duì)照組(P0.001)。同時(shí),氧化應(yīng)激標(biāo)記物4-HNE表達(dá)增加(P0.01),Trx表達(dá)減少(P0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示,autism模型組大鼠PFC和HC腦組織GSK-3βmRNA水平顯著低于對(duì)照組(P0.05),而β-catenin mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P0.01)。同時(shí),抗氧化基因trx1,trx2mRNA表達(dá)下調(diào)(P0.05)。Wnt信號(hào)通路的特異性抑制劑Sulindac作用以后,與autism模型大鼠相比,VPA+Sulindac處理組失活的P-GSK-3p下調(diào)(P0.05),抑制性的P-β-catenin上調(diào)(P0.05),而氧化應(yīng)激標(biāo)記物4-HNE減少(P0.05)。行為學(xué)研究結(jié)果顯示,與autism模型大鼠相比,Sulindac預(yù)處理,大鼠的痛閩相對(duì)正常；重復(fù)刻板動(dòng)作減少；學(xué)習(xí)和記憶能力有所提高。以上結(jié)果表明,Wnt信號(hào)通路抑制劑Sulindac預(yù)處理,能削弱Wnt信號(hào)通路的亢進(jìn)機(jī)能,從而減少氧化應(yīng)激的發(fā)生,最終使autism模型鼠的異常行為獲得不同程度的改善。 三、采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)探討了Wnt/β-catenin通路與氧化應(yīng)激在autism發(fā)生過程中的作用。應(yīng)用Real-time PCR, Western blot及流式細(xì)胞分析(Flow analytical cytometry system, FACS)技術(shù)深入研究VPA處理的原代培養(yǎng)神經(jīng)元Wnt/β-catenin與氧化應(yīng)激的關(guān)系。Real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示,在VPA處理培養(yǎng)神經(jīng)元中,GSK-3βmRNA及蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組,失活的P-GSK-3p顯著高于對(duì)照組；而P-catenin mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組,抑制性的P-β-catenin顯著低于對(duì)照組。同時(shí),在VPA處理培養(yǎng)神經(jīng)元中,4-HNE表達(dá)顯著高于對(duì)照組。FACS研究結(jié)果顯示,VPA處理組ROS表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。Sulindac處理以后,與VPA處理組相比,β-catenin蛋白表達(dá)下調(diào),P-β-catenin表達(dá)上調(diào),GSK-3p表達(dá)上調(diào),P-GSK-3p表達(dá)下調(diào),4-HNE下調(diào)。Real-time PCR結(jié)果顯示,抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)處理雖然減少了ROS的產(chǎn)生,但是并沒有改變GSK-3β mRNA和P-catenin mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果揭示,Wnt/β-catenin通路活性增強(qiáng)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,VPA促進(jìn)神經(jīng)元氧化應(yīng)激的產(chǎn)生由于該通路上調(diào)所致。 綜上所述,我們的工作提示：環(huán)境因素(如VPA暴露)通過誘導(dǎo)腦組織Wnt/β-catenin通路活性改變,使腦內(nèi)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路活性增強(qiáng),進(jìn)而增加氧化應(yīng)激的產(chǎn)生、氧化穩(wěn)態(tài)的異常,有可能進(jìn)一步影響神經(jīng)元的正常發(fā)育和聯(lián)系,阻礙了正常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成,從而引起社會(huì)交往、情緒和語言等行為方面的異常,最終導(dǎo)致autism的發(fā)病。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R749.94

【參考文獻(xiàn)】

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1 李瑞錫;江開達(dá);彭裕文;;孤獨(dú)癥研究新進(jìn)展[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年01期

2 王維霞;王月華;陳明軍;上野照子;小野武年;西條壽夫;李瑞錫;彭裕文;;PV陽性神經(jīng)元在孤獨(dú)癥模型大鼠情緒與認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)內(nèi)的表達(dá)[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2008年02期

3 王月華;姚君茹;陳明軍;李瑞錫;彭裕文;;BDNF免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元在大鼠孤獨(dú)癥動(dòng)物模型大腦頂葉感覺皮層中的表達(dá)[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2008年03期

4 陳明軍;于劍鋒;柴繼俠;徐理;王中平;李瑞錫;彭裕文;;Wnt通路信號(hào)蛋白β-catenin和GSK-3β在孤獨(dú)癥模型大鼠腦中表達(dá)的變化[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2009年04期

5 張建娜;兒童孤獨(dú)癥的診斷與治療現(xiàn)狀[J];中國(guó)醫(yī)刊;2005年04期

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本文編號(hào)：1746322