本文選題：腸道病毒71型　切入點：外周血單個核細(xì)胞　出處：《青島大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：手足口病是由腸道病毒感染引起的急性傳染病,研究表明重癥病例,大部分為腸道病毒71型(enterovirus71, EV71)感染所致,EV71感染可以引起手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹性疾病及神經(jīng)源性肺水腫等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病,而且可以同時侵犯免疫器官和免疫細(xì)胞,從而造成對免疫系統(tǒng)的損害,引起全身多器官的免疫炎性反應(yīng)。目前,針對這種病毒誘導(dǎo)的免疫損傷尚沒有特效的藥物治療,臨床上采用糖皮質(zhì)激素治療可在一定程度上減輕炎癥、緩解癥狀,但是激素治療的同時也抑制了機體的免疫反應(yīng),不僅影響了病毒的清除,還可能促進(jìn)了條件致病菌的繼發(fā)感染。研究發(fā)現(xiàn)：EV71病毒感染后可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生以γ-IFN可誘導(dǎo)的趨化因子IP-10(interferon-gamma inducible protein10)為代表的炎癥瀑布效應(yīng),進(jìn)而刺激多種炎癥細(xì)胞活化,在EV71介導(dǎo)的彌漫性腦損傷與免疫器官損傷而造成免疫功能抑制中起著重要作用。本研究旨在發(fā)現(xiàn)EV71介導(dǎo)的急性免疫損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機制,本課題包括兩部分。 第一部分EV71病毒感染PBMC模型的建立及培養(yǎng)上清中IP-10的檢測 目的成功建立EV71病毒直接感染人外周血單個核細(xì)胞PBMC (human peripheral blood mononuclear cells)的體外模型,為進(jìn)一步從外周血單個核細(xì)胞分子生物學(xué)的角度探討EV71感染后免疫損傷階段的發(fā)病機理奠定基礎(chǔ)。并研究EV71標(biāo)準(zhǔn)毒株作用于外周血單個核細(xì)胞后對趨化因子IP-10生成的影響。 方法以EV71病毒感染外周血單個核細(xì)胞,觀察感染后的細(xì)胞病變,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈方法(RT-PCR)擴增出EV71的特異性條帶。用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測趨化因子干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)的表達(dá)。 結(jié)果外周血單個核細(xì)胞感染EV71病毒后,逐步出現(xiàn)了細(xì)胞病變,RT-PCR可以擴增出EV71的特異性條帶�；A(chǔ)狀態(tài)下,不能檢出IP-10的存在；在100倍半數(shù)感染量(100TCID50) EV71標(biāo)準(zhǔn)毒株及重組人[FN-γ (500U/ml)刺激下,人外周血單個核細(xì)胞PBMC均可檢測到高水平的IP-10表達(dá)(分別為112.89±12.10；80.06±6.23,)。 結(jié)論EV71病毒能夠感染PBMC,并引起明顯的形態(tài)學(xué)改變。EV71病毒感染可以使趨化因子IP-10水平明顯增高,能誘導(dǎo)PBMC合成釋放IP-10。 第二部分研究EV71誘導(dǎo)PBMC合成釋放IP-10(interferon-gamma inducible protein10)的信號分子機制 目的探討EV71感染對PBMC的作用及主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,尋找介導(dǎo)免疫損傷的信號分子節(jié)點。 方法RT-PCR法檢測JAK-STAT信號通路介導(dǎo)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子-干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF-1)、IP-10基因的表達(dá)以及WESTERN-BLOT法檢測磷酸化信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(P-STAT1)的表達(dá)。 結(jié)果RT-PCR結(jié)果證實：EV71病毒誘導(dǎo)了PBMC的IRF-1、IP-10基因的表達(dá)；WESTERN-BLOT方法結(jié)果表明：EV71病毒作用于PBMC誘導(dǎo)了STAT1的磷酸化。 結(jié)論EV71病毒感染PBMC可以使趨化因子IP-10水平明顯增高,IP-10在EV71感染后導(dǎo)致的急性免疫損傷中起重要作用。EV71通過激活JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)IP-10在PBMC的生成,使被EV71感染的PBMC中大量生成和釋放IP-10。STAT1在EV71感染PBMC激活JAK-STAT信號通路中起著極其重要的作用。EV71通過激活的STAT1啟動IRF-1轉(zhuǎn)錄從而啟動IP-10轉(zhuǎn)錄,EV71誘導(dǎo)的JAK-STAT信號通路的激活是EV71感染引起相關(guān)免疫損傷的發(fā)病機制之一。
[Abstract]:The present study shows that EV71 infection can induce the immune response of human body , such as hand - foot - mouth disease , herpes angina , aseptic meningitis , encephalitis , poliomyelitis - like paralysis and neurogenic pulmonary edema .

First part EV71 virus infection PBMC model establishment and culture supernatant IP - 10 detection

Objective To establish an in vitro model of human peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) from peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) of human peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) .

Methods Peripheral blood mononuclear cells were infected with EV71 , and the specific bands of EV71 were amplified by reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . The expression of chemokine interferon inducible protein 10 ( IP - 10 ) was detected by two - step sandwich enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) .

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本文編號：1708340