本文選題：足細(xì)胞　切入點(diǎn)：乙型肝炎病毒X蛋白　出處：《華中科技大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的腎小球足細(xì)胞是一種高度分化的終末細(xì)胞，相鄰兩足突之間相互連接形成的裂孔隔膜構(gòu)成了腎小球最后一道濾過(guò)屏障。對(duì)乙型肝炎病毒相關(guān)性膜性腎�。℉BV-MN）的臨床病理研究顯示患者均存在不同程度的足突融合，提示HBV-MN發(fā)生過(guò)程中存在裂孔隔膜的異常。與原發(fā)性膜性腎病相比，HBV-MN不僅存在補(bǔ)體攻膜復(fù)合物對(duì)足細(xì)胞的損傷，還存在HBV蛋白對(duì)足細(xì)胞的作用，因此本研究通過(guò)構(gòu)建體外足細(xì)胞的亞溶量C5b-9（sC5b-9）模型，利用攜帶HBx基因的復(fù)制缺陷型腺病毒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，觀察sC5b-9和HBx雙重?fù)p傷因素對(duì)培養(yǎng)足細(xì)胞裂孔膜蛋白表達(dá)和分布有何影響。方法通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH活性，采用“棋盤(pán)實(shí)驗(yàn)”的方法確定sC5b-9攻擊足細(xì)胞的抗體和補(bǔ)體濃度，瑞士-吉姆薩染色觀察sC5b-9對(duì)足細(xì)胞形態(tài)的影響，間接免疫熒光染色與激光共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞裂孔膜蛋白分布的變化，western-blot檢測(cè)足細(xì)胞裂孔膜蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果通過(guò)LDH的測(cè)定確定了sC5b-9模型的抗體濃度為1%，補(bǔ)體濃度為1%。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示sC5b-9可以造成足細(xì)胞突觸減少，胞質(zhì)輕微空泡變性，胞核腫脹呈顆粒樣改變，核膜界限模糊等變化。免疫熒光染色顯示sC5b-9和HBx雙重作用下裂孔隔膜蛋白分布異常較單因素更顯著：nephrin主要朝核周分布聚集，胞質(zhì)和突起的表達(dá)急劇減少；空白組podocin和CD2AP在胞質(zhì)均勻分布，膜周呈小顆粒狀，而雙重?fù)p傷組呈粗絲狀或者大顆粒樣分布于膜周和突起。western blot檢測(cè)顯示雙重?fù)p傷組較sC5b-9單因素?fù)p傷組CD2AP、nephrin的表達(dá)顯著減少，podocin的表達(dá)反而升高；與HBx單因素?fù)p傷組比較，CD2AP、nephrin和podocin的表達(dá)均顯著降低。結(jié)論sC5b-9和HBx蛋白雙重因素可以加重裂孔膜蛋白的損傷。這揭示了在HBV-MN疾病進(jìn)程中補(bǔ)體攻膜復(fù)合物和HBx蛋白可能共同發(fā)揮損傷足細(xì)胞的作用，損傷的靶點(diǎn)為裂孔膜蛋白，將為HBV-MN的診療提供新的思路。
[Abstract]:Objective glomerular podocytes are highly differentiated terminal cells. The fissure membrane formed by the connection between the adjacent two podocytes forms the last filtration barrier of the glomeruli. The clinicopathological studies of HBV-MNs in patients with hepatitis B virus associated membranous nephropathy (HBV-MN) show that there are various degrees of foot process fusion in all patients. Compared with primary membranous nephropathy, HBV-MN has not only the damage of complement attack membrane complex on podocyte, but also the effect of HBV protein on podocyte. In this study, we constructed the model of subsolubilization of podocyte C5b-9sC5b-9 in vitro, and transfected podocyte into podocyte by replication-deficient adenovirus carrying HBx gene. To observe the effect of sC5b-9 and HBx on the expression and distribution of lobes membrane protein in cultured podocytes. Methods the activity of LDH in the supernatants of cultured podocytes was detected. The concentration of antibody and complement of sC5b-9 attack podocyte was determined by "chessboard experiment", and the effect of sC5b-9 on podocyte morphology was observed by Swiss-Gimsa staining. Indirect immunofluorescence staining and laser confocal microscopy observed the changes of protein distribution in podocytes by Western blot. Results the antibody concentration of sC5b-9 model was determined by LDH analysis. (1) the complement concentration is 1. Morphological observation shows that sC5b-9 can cause synapse reduction in podocytes. The cytoplasm showed slight vacuolar degeneration, nuclear swelling showed granular changes, and the nuclear membrane boundaries were blurred. Immunofluorescence staining showed that the abnormal distribution of membrane proteins in the split cell membrane under the action of sC5b-9 and HBx was significantly higher than that of single factor. The expression of podocin and CD2AP in the cytoplasm of the blank group was evenly distributed, and the membrane around the membrane was small granular, while the expression of cytoplasm and protuberance decreased sharply. In the double injury group, the expression of CD2APPnphrin was significantly decreased in the double injury group compared with that in the univariate sC5b-9 injury group, and the expression of ppodocin was significantly increased in the double injury group. The results showed that the expression of CD2APPnphrin in the double injury group was significantly lower than that in the sC5b-9 univariate injury group. Compared with the univariate HBx injury group, the expression of CD2APPnphrin and podocin decreased significantly. Conclusion the double factors of sC5b-9 and HBx protein can aggravate the damage of the membrane protein. This suggests that the complement attack membrane complex and the HBx protein may play an important role in the process of HBV-MN disease. To work together to damage podocytes, The target of injury is hiatus membrane protein, which will provide a new idea for the diagnosis and treatment of HBV-MN.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R726.9

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本文編號(hào)：1645770