本文選題：miR-148a　切入點(diǎn)：HMSC-Ad　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：肥胖是一種機(jī)體脂肪組織總含量過(guò)多和(或)局部含量增多及分布異常的慢性代謝性疾病。肥胖病人發(fā)生心血管疾病(CVD)、高血壓、血脂異常、2型糖尿病、脂肪肝及某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增高,是目前位居全球第5位的死亡原因。近20年,中國(guó)肥胖人口比例逐年呈上升和年輕化趨勢(shì),流行程度已經(jīng)接近發(fā)達(dá)國(guó)家水平(美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家肥胖比例超過(guò)1/3),嚴(yán)重威脅我國(guó)國(guó)民體質(zhì)與生命健康,已成為我國(guó)亟需解決的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。 肥胖是脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加以及脂肪細(xì)胞的體積變大雙重作用的結(jié)局,其中脂肪細(xì)胞體積增大(取決于脂肪細(xì)胞分化程度)較之其數(shù)目增多對(duì)體內(nèi)脂肪的含量及代謝穩(wěn)態(tài)的影響更為顯著；脂肪組織中脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞或脂肪前體細(xì)胞在遺傳、環(huán)境、飲食等各種因素作用下改變了增殖分化潛能可能是肥胖難以控制的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)；因此,以人脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Human adipose-derived mesenchymal stem cells,HMSC-Ad)為研究對(duì)象,深入研究其基本屬性,特別是從脂肪細(xì)胞分化的角度尋找肥胖防治新靶標(biāo)、新機(jī)制、深入研究相關(guān)機(jī)制仍十分必要,并可能為肥胖及相關(guān)代謝性疾病提供潛在的分子靶標(biāo)。 近年來(lái)隨著生命科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,對(duì)發(fā)育、疾病機(jī)制的解釋越來(lái)越豐富,已經(jīng)不再局限于基因或蛋白水平,以往被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄垃圾、不編碼蛋白的非編碼RNA因?yàn)楣δ芫薮蠖饾u受到重視。其中一類(lèi)長(zhǎng)度僅22nt、在基因轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)負(fù)向調(diào)控基因的非編碼小RNA分子——microRNA(miRNA)在各個(gè)領(lǐng)域最為活躍,極大拓寬了人們對(duì)生物發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)。雖然發(fā)現(xiàn)miRNA距今僅20年,但目前至少已有20多項(xiàng)miRNA相關(guān)藥物的研發(fā)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。而miRNA一對(duì)多、多對(duì)一的作用方式(一個(gè)miRNA調(diào)控多個(gè)基因或多個(gè)miRNA對(duì)同一個(gè)基因進(jìn)行時(shí)空特異的精密調(diào)控),無(wú)疑是解決復(fù)雜疑難疾病的新切入點(diǎn)。miRNA在肥胖、脂肪細(xì)胞分化中的作用已有部分研究,但是與miRNA的總數(shù)相比微乎其微,因此繼續(xù)探討肥胖相關(guān)miRNA功能與機(jī)制研究,將給肥胖與相關(guān)代謝性疾病的防治帶來(lái)福音。 本課題組前期通過(guò)miRNA芯片技術(shù),篩選人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及成熟脂肪細(xì)胞的miRNA差異表達(dá)譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148a在脂肪細(xì)胞分化前后差異表達(dá)特征十分顯著,結(jié)合Dicer(生成miRNA的關(guān)鍵酶)脂肪特異性敲除可以導(dǎo)致小鼠脂肪發(fā)育異常的報(bào)道,提示miRNA在脂肪細(xì)胞分化的重要作用。因此,本研究首先從細(xì)胞、動(dòng)物、人群不同水平探討miR-148a與肥胖的相關(guān)性,并通過(guò)生物信息學(xué)分析miR-148a作用的靶基因集合富集的信號(hào)通路和功能集合,為深入開(kāi)展miR-148a在肥胖發(fā)生中的功能研究提供實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)；進(jìn)一步以HMSC-Ad為研究對(duì)象,探討miR-148a在HMSC-Ad成脂分化中的作用,并闡明miR-148a下游分子途徑及上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,有望為肥胖及其并發(fā)癥防治提供新線索及潛在的干預(yù)靶標(biāo)。 第一部分miR-148a與肥胖相關(guān)性的探討 目的：通過(guò)觀察miR-148a在脂肪細(xì)胞、肥胖者脂肪組織、高脂飲食(high fat diet,HFD)誘導(dǎo)肥胖小鼠脂肪組織中的表達(dá)特征,并對(duì)miR-148a進(jìn)行生物信息分析,探討miR-148a與肥胖的相關(guān)性,為闡明miR-148a在肥胖中作用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：選擇人脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞HMSC-Ad、人脂肪前體細(xì)胞Pre-Ad (Human pre-adipocyte)、小鼠脂肪前體細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞,以胰島素、地塞米松、羅格列酮(3T3-L1細(xì)胞除外)、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(MIX)方案誘導(dǎo)各細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞；選取肥胖/超重人群(BMI≥24)皮下脂肪組織12例,以BMI(17-23.9)正常人群皮下脂肪組織(18例)為對(duì)照；構(gòu)建HFD誘導(dǎo)肥胖小鼠模型,獲取皮下脂肪組織；針對(duì)上述樣本,采用Realtime PC技術(shù)檢測(cè)miR-148a在脂肪細(xì)胞、肥胖者、HFD小鼠脂肪組織中的表達(dá)水平；采用miRBase檢索miR-148a的序列特征,分析其物種保守性；采用TargetScan、Pictar和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)檢索miR-148a的靶基因,取三者交集得到靶基因結(jié)合,對(duì)靶基因集合進(jìn)行GO分析和pathway分析。 結(jié)果：1) miR-148a在HMSC-Ad、Pre-Ad、3T3-L1誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞中呈高表達(dá)模式；2)與BMI正常人群相比,miR-148a高表達(dá)于肥胖者腹部皮下脂肪組織；3) miR-148a在HFD誘導(dǎo)肥胖小鼠皮下脂肪組織中呈高表達(dá)特征；4)miR-148a具有物種保守性,對(duì)miR-148a的靶基因進(jìn)行GO分析和pathway分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),靶基因功能主要富集于肥胖胰島素抵抗及脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)的信號(hào)通路,如Wnt信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、脂因子信號(hào)通路、細(xì)胞周期信號(hào)通路和DNA甲基化。 結(jié)論：通過(guò)檢測(cè)不同肥胖生物中miR-148a的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-148a與肥胖密切相關(guān),表現(xiàn)為在肥胖者脂肪組織、分化成熟脂肪細(xì)胞中高表達(dá),miR-148a靶基因功能富集于肥胖及脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)通路,為后續(xù)進(jìn)行miR-148在肥胖中的功能研究奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分miR-148a過(guò)表達(dá)對(duì)HMSC-Ad成脂分化的影響及機(jī)制研究 目的：觀察miR-148a過(guò)表達(dá)對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(HMSC-Ad)成脂分化的影響,并探討其促進(jìn)成脂分化的機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)穩(wěn)定感染miR-148a慢病毒的HMSC-Ad細(xì)胞,以轉(zhuǎn)染空載病毒的HMSC-Ad細(xì)胞為對(duì)照,胰島素、地塞米松、羅格列酮、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(MIX)方案誘導(dǎo)細(xì)胞分化成熟。油紅O觀察HMSC-Ad成脂分化過(guò)程中脂滴形成情況；酶比色法檢測(cè)成熟脂肪細(xì)胞中的甘油三酯含量；檢測(cè)成熟脂肪細(xì)胞中甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)酶的活性。采用Realtime PC及Western Blot技術(shù),檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因(PPARγ2、C/EBP-α、FABP4)及miR-148a靶基因Wnt1的mRNA及蛋白水平；同時(shí)檢測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中信號(hào)分子(GSK-3β、 p-GSK-3β、β-catenin)蛋白水平。采用螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選miR-148a可能作用的信號(hào)通路及靶基因。 結(jié)果：1)過(guò)表達(dá)miR-148a促進(jìn)HMSC-Ad誘導(dǎo)的成熟脂肪細(xì)胞脂滴形成、甘油三酯合成、GPDH活性,上調(diào)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因PPARγ2、C/EBP-α、FABP4mRNA及蛋白水平的表達(dá)；2) miR-148激活PPRE螢光素酶活性(PPAR反應(yīng)元件)、抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路Report TopFlash螢光素酶活性；3) miR-148a可結(jié)合至靶基因Wnt13'UTR區(qū)并抑制其蛋白表達(dá)；4) miR-148a過(guò)表達(dá)抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中Wnt1總蛋白表達(dá)、增力p-GSK-3β水平,而β-cateni入核水平減少；5)miR-148a可部分逆轉(zhuǎn)Wnt1對(duì)HMSC-Ad成脂分化的抑制作用,即在HMSC-Ad中敲低Wnt1基因可促進(jìn)成脂分化關(guān)鍵基因表達(dá)及脂滴的形成(與miR-148a過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的作用一致),而miR-148a與Wnt1在HMSC-Ad中共表達(dá)或miR-148a過(guò)表達(dá)可部分阻斷由Wnt1過(guò)表達(dá)所致的作用(脂滴形成減少、脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因表達(dá)下調(diào)等)。 結(jié)論：1) miR-148a過(guò)表達(dá)促進(jìn)HMSC-Ad成脂分化：2) miR-148在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因Wnt1的表達(dá),從而抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路活性,并阻斷Wnt1對(duì)HMSC-Ad成脂分化的抑制作用,提示miR-148a是促進(jìn)HMSC-Ad成脂分化的上游調(diào)控因素,并非是分化產(chǎn)生的效應(yīng)。 第三部分miR-148a在人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制 目的：尋找miR-148a核心啟動(dòng)子區(qū)域并探討miR-148在HMSC-Ad中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。 方法：應(yīng)用NCBI Mapviewer、UCSC Genome Browser等工具預(yù)測(cè)miR-148a啟動(dòng)子區(qū)域,采用TFSEARCH預(yù)測(cè)miR-148a啟動(dòng)子區(qū)域與脂肪細(xì)胞分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；構(gòu)建啟動(dòng)子熒光蛋白檢測(cè)報(bào)告質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,72h內(nèi)采用熒光顯微鏡觀察報(bào)告熒光蛋白的表達(dá)；采用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng),檢測(cè)克隆不同區(qū)域miR-148a啟動(dòng)子的活性；EMSA和ChIP-qPCR分析何種轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合至miR-148a啟動(dòng)子區(qū)域；采用Realtime PCR檢測(cè)miR-148a表達(dá)水平,評(píng)價(jià)在HMSC-Ad細(xì)胞中過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子CREB對(duì)miR-148a表達(dá)的影響。 結(jié)果：1)啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)miR-148a屬于基因間RNA(intergenic),具有獨(dú)立啟動(dòng)子,具有CpG島,預(yù)測(cè)其可能的啟動(dòng)子區(qū)域位于pre-miR-148a上游3000kb處,并發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域存在脂肪細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CREB、E2F、CEBP等結(jié)合位點(diǎn)；2) pre-miR-148a上游(-2947to-2687nt)處為miR-148a核心啟動(dòng)子區(qū)域,并具有轉(zhuǎn)錄因子CREB結(jié)合位點(diǎn)；3)在HMSC-Ad細(xì)胞中,采用EMSA證實(shí)CREB、E2F可結(jié)合至miR-148a啟動(dòng)子區(qū)域(-2947to-2687nt),同時(shí)ChlP-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含有CREB結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域(-2947to-2687nt) IP表達(dá)量是input的320倍；4)HMSC-Ad細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CREB, miR-148a滾達(dá)水平較對(duì)照組增加2.6倍。反之,HMSC-Ad細(xì)胞中沉默CREB, miR-148a表達(dá)水平較對(duì)照組降低約70%。 結(jié)論：CREB(一種與脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合至miR-148a啟動(dòng)子區(qū)域,調(diào)控miR-148a的表達(dá),提示miR-148a是CREB依賴的miRNA。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R723.14

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1557284