本文選題：miR-148a　切入點：HMSC-Ad　出處：《南京醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：肥胖是一種機體脂肪組織總含量過多和(或)局部含量增多及分布異常的慢性代謝性疾病。肥胖病人發(fā)生心血管疾病(CVD)、高血壓、血脂異常、2型糖尿病、脂肪肝及某些癌癥的風險增高,是目前位居全球第5位的死亡原因。近20年,中國肥胖人口比例逐年呈上升和年輕化趨勢,流行程度已經(jīng)接近發(fā)達國家水平(美國等發(fā)達國家肥胖比例超過1/3),嚴重威脅我國國民體質與生命健康,已成為我國亟需解決的重大公共衛(wèi)生問題。 肥胖是脂肪細胞數(shù)量的增加以及脂肪細胞的體積變大雙重作用的結局,其中脂肪細胞體積增大(取決于脂肪細胞分化程度)較之其數(shù)目增多對體內脂肪的含量及代謝穩(wěn)態(tài)的影響更為顯著；脂肪組織中脂肪間充質干細胞或脂肪前體細胞在遺傳、環(huán)境、飲食等各種因素作用下改變了增殖分化潛能可能是肥胖難以控制的細胞生物學基礎；因此,以人脂肪組織來源的間充質干細胞(Human adipose-derived mesenchymal stem cells,HMSC-Ad)為研究對象,深入研究其基本屬性,特別是從脂肪細胞分化的角度尋找肥胖防治新靶標、新機制、深入研究相關機制仍十分必要,并可能為肥胖及相關代謝性疾病提供潛在的分子靶標。 近年來隨著生命科學技術的迅猛發(fā)展,對發(fā)育、疾病機制的解釋越來越豐富,已經(jīng)不再局限于基因或蛋白水平,以往被認為是轉錄垃圾、不編碼蛋白的非編碼RNA因為功能巨大而逐漸受到重視。其中一類長度僅22nt、在基因轉錄后水平實現(xiàn)負向調控基因的非編碼小RNA分子——microRNA(miRNA)在各個領域最為活躍,極大拓寬了人們對生物發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展的認識。雖然發(fā)現(xiàn)miRNA距今僅20年,但目前至少已有20多項miRNA相關藥物的研發(fā)進入臨床試驗階段。而miRNA一對多、多對一的作用方式(一個miRNA調控多個基因或多個miRNA對同一個基因進行時空特異的精密調控),無疑是解決復雜疑難疾病的新切入點。miRNA在肥胖、脂肪細胞分化中的作用已有部分研究,但是與miRNA的總數(shù)相比微乎其微,因此繼續(xù)探討肥胖相關miRNA功能與機制研究,將給肥胖與相關代謝性疾病的防治帶來福音。 本課題組前期通過miRNA芯片技術,篩選人脂肪間充質干細胞及成熟脂肪細胞的miRNA差異表達譜,結果發(fā)現(xiàn)miR-148a在脂肪細胞分化前后差異表達特征十分顯著,結合Dicer(生成miRNA的關鍵酶)脂肪特異性敲除可以導致小鼠脂肪發(fā)育異常的報道,提示miRNA在脂肪細胞分化的重要作用。因此,本研究首先從細胞、動物、人群不同水平探討miR-148a與肥胖的相關性,并通過生物信息學分析miR-148a作用的靶基因集合富集的信號通路和功能集合,為深入開展miR-148a在肥胖發(fā)生中的功能研究提供實驗及理論基礎；進一步以HMSC-Ad為研究對象,探討miR-148a在HMSC-Ad成脂分化中的作用,并闡明miR-148a下游分子途徑及上游轉錄調控機制,有望為肥胖及其并發(fā)癥防治提供新線索及潛在的干預靶標。 第一部分miR-148a與肥胖相關性的探討 目的：通過觀察miR-148a在脂肪細胞、肥胖者脂肪組織、高脂飲食(high fat diet,HFD)誘導肥胖小鼠脂肪組織中的表達特征,并對miR-148a進行生物信息分析,探討miR-148a與肥胖的相關性,為闡明miR-148a在肥胖中作用提供理論和實驗基礎。 方法：選擇人脂肪組織來源的間充質干細胞HMSC-Ad、人脂肪前體細胞Pre-Ad (Human pre-adipocyte)、小鼠脂肪前體細胞3T3-L1細胞,以胰島素、地塞米松、羅格列酮(3T3-L1細胞除外)、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(MIX)方案誘導各細胞分化為成熟脂肪細胞；選取肥胖/超重人群(BMI≥24)皮下脂肪組織12例,以BMI(17-23.9)正常人群皮下脂肪組織(18例)為對照；構建HFD誘導肥胖小鼠模型,獲取皮下脂肪組織；針對上述樣本,采用Realtime PC技術檢測miR-148a在脂肪細胞、肥胖者、HFD小鼠脂肪組織中的表達水平；采用miRBase檢索miR-148a的序列特征,分析其物種保守性；采用TargetScan、Pictar和miRanda數(shù)據(jù)庫檢索miR-148a的靶基因,取三者交集得到靶基因結合,對靶基因集合進行GO分析和pathway分析。 結果：1) miR-148a在HMSC-Ad、Pre-Ad、3T3-L1誘導分化成熟的脂肪細胞中呈高表達模式；2)與BMI正常人群相比,miR-148a高表達于肥胖者腹部皮下脂肪組織；3) miR-148a在HFD誘導肥胖小鼠皮下脂肪組織中呈高表達特征；4)miR-148a具有物種保守性,對miR-148a的靶基因進行GO分析和pathway分析,結果發(fā)現(xiàn),靶基因功能主要富集于肥胖胰島素抵抗及脂肪細胞分化密切相關的信號通路,如Wnt信號通路、TGF-β信號通路、胰島素信號通路、脂因子信號通路、細胞周期信號通路和DNA甲基化。 結論：通過檢測不同肥胖生物中miR-148a的表達,發(fā)現(xiàn)miR-148a與肥胖密切相關,表現(xiàn)為在肥胖者脂肪組織、分化成熟脂肪細胞中高表達,miR-148a靶基因功能富集于肥胖及脂肪細胞分化相關的信號通路,為后續(xù)進行miR-148在肥胖中的功能研究奠定了理論和實驗基礎。 第二部分miR-148a過表達對HMSC-Ad成脂分化的影響及機制研究 目的：觀察miR-148a過表達對人脂肪間充質干細胞(HMSC-Ad)成脂分化的影響,并探討其促進成脂分化的機制。 方法：體外培養(yǎng)穩(wěn)定感染miR-148a慢病毒的HMSC-Ad細胞,以轉染空載病毒的HMSC-Ad細胞為對照,胰島素、地塞米松、羅格列酮、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(MIX)方案誘導細胞分化成熟。油紅O觀察HMSC-Ad成脂分化過程中脂滴形成情況；酶比色法檢測成熟脂肪細胞中的甘油三酯含量；檢測成熟脂肪細胞中甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)酶的活性。采用Realtime PC及Western Blot技術,檢測脂肪細胞分化關鍵基因(PPARγ2、C/EBP-α、FABP4)及miR-148a靶基因Wnt1的mRNA及蛋白水平；同時檢測經(jīng)典Wnt信號通路中信號分子(GSK-3β、 p-GSK-3β、β-catenin)蛋白水平。采用螢光素酶報告系統(tǒng)篩選miR-148a可能作用的信號通路及靶基因。 結果：1)過表達miR-148a促進HMSC-Ad誘導的成熟脂肪細胞脂滴形成、甘油三酯合成、GPDH活性,上調脂肪細胞分化關鍵基因PPARγ2、C/EBP-α、FABP4mRNA及蛋白水平的表達；2) miR-148激活PPRE螢光素酶活性(PPAR反應元件)、抑制經(jīng)典Wnt信號通路Report TopFlash螢光素酶活性；3) miR-148a可結合至靶基因Wnt13'UTR區(qū)并抑制其蛋白表達；4) miR-148a過表達抑制經(jīng)典Wnt信號通路中Wnt1總蛋白表達、增力p-GSK-3β水平,而β-cateni入核水平減少；5)miR-148a可部分逆轉Wnt1對HMSC-Ad成脂分化的抑制作用,即在HMSC-Ad中敲低Wnt1基因可促進成脂分化關鍵基因表達及脂滴的形成(與miR-148a過表達產(chǎn)生的作用一致),而miR-148a與Wnt1在HMSC-Ad中共表達或miR-148a過表達可部分阻斷由Wnt1過表達所致的作用(脂滴形成減少、脂肪細胞分化關鍵基因表達下調等)。 結論：1) miR-148a過表達促進HMSC-Ad成脂分化：2) miR-148在轉錄后水平調控靶基因Wnt1的表達,從而抑制經(jīng)典Wnt信號通路活性,并阻斷Wnt1對HMSC-Ad成脂分化的抑制作用,提示miR-148a是促進HMSC-Ad成脂分化的上游調控因素,并非是分化產(chǎn)生的效應。 第三部分miR-148a在人脂肪源性間充質干細胞中的轉錄調控機制 目的：尋找miR-148a核心啟動子區(qū)域并探討miR-148在HMSC-Ad中的轉錄調控機制。 方法：應用NCBI Mapviewer、UCSC Genome Browser等工具預測miR-148a啟動子區(qū)域,采用TFSEARCH預測miR-148a啟動子區(qū)域與脂肪細胞分化有關的轉錄因子結合位點；構建啟動子熒光蛋白檢測報告質粒,轉染至HEK293T細胞,72h內采用熒光顯微鏡觀察報告熒光蛋白的表達；采用雙螢光素酶報告系統(tǒng),檢測克隆不同區(qū)域miR-148a啟動子的活性；EMSA和ChIP-qPCR分析何種轉錄因子可結合至miR-148a啟動子區(qū)域；采用Realtime PCR檢測miR-148a表達水平,評價在HMSC-Ad細胞中過表達轉錄因子CREB對miR-148a表達的影響。 結果：1)啟動子分析發(fā)現(xiàn)miR-148a屬于基因間RNA(intergenic),具有獨立啟動子,具有CpG島,預測其可能的啟動子區(qū)域位于pre-miR-148a上游3000kb處,并發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域存在脂肪細胞分化相關轉錄因子CREB、E2F、CEBP等結合位點；2) pre-miR-148a上游(-2947to-2687nt)處為miR-148a核心啟動子區(qū)域,并具有轉錄因子CREB結合位點；3)在HMSC-Ad細胞中,采用EMSA證實CREB、E2F可結合至miR-148a啟動子區(qū)域(-2947to-2687nt),同時ChlP-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)含有CREB結合位點的區(qū)域(-2947to-2687nt) IP表達量是input的320倍；4)HMSC-Ad細胞中過表達CREB, miR-148a滾達水平較對照組增加2.6倍。反之,HMSC-Ad細胞中沉默CREB, miR-148a表達水平較對照組降低約70%。 結論：CREB(一種與脂肪細胞分化密切相關的轉錄因子)結合至miR-148a啟動子區(qū)域,調控miR-148a的表達,提示miR-148a是CREB依賴的miRNA。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R723.14

【共引文獻】

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本文編號：1557284