本文關鍵詞：遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥家系基因型與臨床表型相關性研究　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥(Genetic epilepsy with febrile seizures plus, GEFS+)是從全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥(Generalized epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)衍化來的概念。全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥是Scheffer等人于1997年在研究一個熱性驚厥大家系中首先總結(jié)的一種癲癇綜合征。全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥與其他的癲癇綜合征不同,其診斷并不局限于個體,是一個以家系為整體進行診斷的癲癇綜合征。Scheffer首先歸納其發(fā)作表型譜包括：最常見的熱性驚厥(febrile seizure, FS),其次是熱性驚厥附加癥(febrile seizure plus, FS+),表現(xiàn)為熱性驚厥的年齡超過6歲和／或出現(xiàn)無熱的全面性強直陣攣發(fā)作；其他表現(xiàn)包括FS+伴有其他全面性發(fā)作(如FS+伴有失神、肌陣攣或者失張力等),少見的表型如肌陣攣站立不能性癲癇(myoclonic-astatic epilepsy,MAE)。進一步的基礎研究發(fā)現(xiàn)GEFS+是呈常染色體顯性遺傳,表型異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性極高。隨后,通過眾多的GEFS+家系的分析和報道,不斷完善其發(fā)作譜,現(xiàn)認為還包括FS+伴部分性發(fā)作、嬰兒嚴重肌陣攣性癲癇(severe myoclonic epilepsy of infancy, SMEI),又名Dravet綜合征(Dravet syndrom)。由于全面性發(fā)作和部分性發(fā)作在不同家系,家系不同成員或同一成員中同時并存,因此全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥的命名也受到挑戰(zhàn)。2008年始,最早提出GEFS+定義的Scheffer將GEFS+中字母G代表的Generalized換為Genetic,即遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥(Genetic epilepsy with febrile seizures plus, GEFS+), GEFS+這一概念的范圍進一步擴大,覆蓋了更多與FS相關的遺傳性癲癇,甚至已經(jīng)擴大到所有與熱性驚厥有關的遺傳性癲癇。目前國際抗癲癇聯(lián)盟已認可遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥的命名,其共有的特點是都有熱性驚厥發(fā)作家族史,但伴隨的其他癲癇發(fā)作類型則有所差異,從單一到復雜、輕微到嚴重。2009年,Scheffer提出GEFS+家系至少要有2名患者符合GEFS+發(fā)作譜,有的家系可能僅表現(xiàn)為FS一種表型,即單純FS家系也被并入到GEFS+范疇。 與熱相關的驚厥的發(fā)病機制研究主要有三個方面,第一：溫度對離子通道的影響。第二：熱性介質(zhì)白細胞介素(Interleukin-1β,IL-1β)的作用,第三：遺傳因素與熱性驚厥的關系非常密切。GEFS+發(fā)病是遺傳因素和外部環(huán)境共同作用的結(jié)果,與發(fā)熱相關的驚厥的基因研究主要針對編碼鈉離子通道、γ-氨基丁酸(GABA)受體、白介素的基因。目前與遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥相關的離子通道蛋白亞單位基因主要有SCN1A、SCN1B、GABRG2、GABRD,分別編碼電壓門控鈉離子通道α1、β1亞單位和配體門控氯離子通道GABAA受體γ2、6亞單位。最早證實基因突變與GEFS+致病有關是1998年在GEFS+患者中發(fā)現(xiàn)SCN1B基因突變。2000年首次在GEFS+患者中發(fā)現(xiàn)SCN1A基因錯義突變,2001年分別發(fā)現(xiàn)SCN2A、GABRG2基因錯義突變,2004年證實GABRD與GEFS+有關,2009年在SCN9A基因發(fā)現(xiàn)錯義突變。其中編碼Nav1.1的基因SCN1A突變是引起遺傳性和散發(fā)性癲癇最常見的因素。 不同的抗癲癇藥物作用于不同的離子通道。鈉離子通道調(diào)控的是中樞神經(jīng)興奮性突觸,作用于電壓門控性鈉通道的抗癲癇藥有卡馬西平、奧卡西平、拉莫三嗪、苯妥英鈉、托吡酯、拉科酰胺、唑尼沙胺、非氨酯、盧非酰胺,另外丙戊酸鈉、加巴噴丁對鈉通道的作用效果尚無定論。抑制性突觸由GABA能離子通道調(diào)控,作用于GABA的抗癲癇藥有苯二氮卓類、苯巴比妥、丙戊酸鈉、托吡酯、加巴賁丁、氨已烯酸、非氨酯、噻加賓,另外左乙拉西坦對GABA作用尚無定論。理論上某種通道病變,應用作用于該通道的藥物治療有效,但臨床上通道突變和藥物反應性的關系也表現(xiàn)出相反的一面,通道突變可能改變通道的激活、失活、關閉等狀態(tài),使原作用于該通道的藥物失效甚至發(fā)作加重。了解通道的狀態(tài),根據(jù)個體發(fā)病機制選擇合適的抗癲癇藥治療。基因型與藥物反應關系的研究結(jié)果將幫助我們決定該選用何種抗癲癇藥或避免選用何種抗癲癇藥。 [對象和方法] 1.對象：收集2010年～2013年在廣東省人民醫(yī)院門診及住院部確診的GEFS+家系17個,選取200例健康人群為正常對照組,對照組無神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀和體征,無相關疾病家族史。所有研究對象或其法定監(jiān)護人均簽署知情同意書,研究獲得廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準。 2.臨床資料：對家系成員進行詳細的病史采集、體格檢查,完善長程視頻腦電圖、頭顱MRI等檢查。建立詳細資料庫,包括年齡,性別,發(fā)作的相關資料(首次發(fā)作的年齡、發(fā)作的類型、首次發(fā)作是否與發(fā)熱性疾病相關、隨后的各種發(fā)作類型、頻率),精神運動發(fā)育初步評估,神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征,腦電圖和頭顱影像學資料,服藥情況,治療效果,家族史,個人史、既往史等,并繪制家系圖譜。家系受累成員發(fā)作類型根據(jù)ILAE2010年的癲癇發(fā)作和癲癇綜合征分類標準進行診斷。 3.方法 (1)視頻腦電監(jiān)測：將病人安置于安靜無干擾的單人病房,采用NICOLETONE腦電圖掃描儀,按照10/20系統(tǒng)單、雙極放置電極。進行各種誘發(fā)試驗(睜閉眼、閃光刺激、睡眠誘發(fā)),實時監(jiān)測24小時內(nèi)各項活動、發(fā)作情況及腦電情況。每次記錄均由兩名專業(yè)醫(yī)師判斷結(jié)果。 (2)MRI掃描檢查：MRI序列采用飛利浦MR掃描儀,Philip Achieva3.0T超導磁共振成像系統(tǒng),所有患者行橫斷位快速自旋回波T2WI、T1WI以及橫斷位、冠狀位、矢狀位自旋回波T1WI增強檢查。MRI結(jié)果均由兩名專業(yè)醫(yī)師判斷結(jié)果。 (3)采集GEFS+家系成員78例和健康對照人群200例外周靜脈血樣5mL,EDTA抗凝,提取基因組DNA (QIAamp DNA Mini Kit試劑盒).。 (4)應用PCR產(chǎn)物Sanger測序技術對78例家系成員血標本進行SCN1A、 GABRG2、GABRG2、GABRD基因所有外顯子檢測。設計PCR擴增引物,從NCBI數(shù)據(jù)庫查找出目的基因(SCN1A、SCN1B、GABRG2、GABRD)的cDNA序列,然后在UCSC數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/)查找出4個基因全部外顯子、內(nèi)含子序列,并確定其外顯子和內(nèi)含子的分界,運用Primer3.0軟件在線設計目的片段引物。PCR反應擴增目的基因,純化PCR產(chǎn)物,純化產(chǎn)物進行測序反應,測序產(chǎn)物進行純化與變性,應用ABI3730測序儀進行測序,分析測序結(jié)果,并與基因標準序列進行比對,確定可能的突變位點后,擴增200例健康對照者相關基因片斷進行比對,排除該位點的基因多態(tài)性。如確定為突變位點,結(jié)合密碼子、氨基酸表進一步明確堿基改變是否導致編碼氨基酸的改變。 (5)分析攜帶突變患者家系臨床資料和基因測序結(jié)果,以分析變異遺傳方式、遺傳路徑,分析基因型與表型、基因型與藥物治療效果之間的關系。 [結(jié)果] 1.發(fā)現(xiàn)了2個GEFS+家系(2/17,11.76%)共5人存在SCNIA基因突變,均為錯義突變,突變位點國內(nèi)外未見報道。 2.SCN1A基因突變的2個GEFS+家系的特點：①家系1的先證者、妹妹、父親第3外顯子存在雜合突變(c.425GA),密碼子由TGT變?yōu)門AT,其編碼氨基酸由半胱氨酸(Cysteine,縮寫為Cys或C)變?yōu)槔野彼?Tyrosine,縮寫為Tyr或T),該突變?yōu)殄e義突變(C142T)。突變位點位于鈉離子通道α亞單位蛋白結(jié)構域D I跨膜片段S6,突變位于高度保守區(qū)域。先證者和妹妹臨床表型為熱性驚厥附加癥,發(fā)作形式為全面性強直陣攣發(fā)作,腦電圖表現(xiàn)為各區(qū)頻發(fā)尖慢波、棘慢波,服用丙戊酸鈉后發(fā)作控制,癇樣放電抑制。②家系2：先證者、母親第11外顯子存在雜合突變(c.1719CA),密碼子由AGC變?yōu)锳GA,導致編碼氨基酸由絲氨酸(Serine,縮寫Ser或S)變?yōu)榫彼?Arginine,縮寫Arg或R),該突變?yōu)殄e義突變(S573R),該突變位點位于鈉離子通道α亞單位蛋白結(jié)構域D Ⅳ S5-S6連接環(huán),為孔區(qū)內(nèi)結(jié)構,突變位于高度保守區(qū)域。先證者表型為熱性驚厥附加癥伴部分性發(fā)作,腦電圖表現(xiàn)為左顳頻發(fā)尖慢波、棘慢波、多棘慢波。該患兒服用奧卡西平后發(fā)作頻率增加,腦電圖無改善,改用左乙拉西坦后發(fā)作控制,癇樣放電抑制。 3.在1個GEFS+家系(1/17,5.88%)發(fā)現(xiàn)SCN1B基因同義突變。在先證者、母親第3外顯子發(fā)現(xiàn)雜合變異(c.270GT),密碼子由GTG變?yōu)镚TT,但編碼氨基酸不變,仍為纈氨酸(Valine,縮寫Val或V),該突變?yōu)橥x突變(V90V)。先證者為女性,表型為熱性驚厥附加癥,發(fā)作類型為全面性強直陣攣發(fā)作(GTCS),予丙戊酸鈉治療,發(fā)作控制。 4. GEFS+家系GABRG2、GABRD基因所有外顯子未發(fā)現(xiàn)突變。 5.在GEFS+家系患者的SCN1A基因發(fā)現(xiàn)4個SNP位點(rs7580482,rs2298771,rs150638891,rs150570058)。SCN1B基因發(fā)現(xiàn)1個SNP位點(rs3746255)。GABRG2基因發(fā)現(xiàn)2個SNP位點(rs11135176,rs211037)。GABRD基因發(fā)現(xiàn)1個SNP位點(rs2229110)。 [結(jié)論] 1.在17個GEFS+家系中,發(fā)現(xiàn)了2個家系共5人存在SCN1A基因雜合錯義突變(分別是C142T、S573R位點),該位點國內(nèi)外未見報道。 2.發(fā)現(xiàn)了1個家系共2人存在SCN1B基因雜合同義突變(V90V)位點,該位點國內(nèi)外未見報道。 3.GABRG2、GABRD基因未發(fā)現(xiàn)突變,推測(?)GABRG2、GABRD基因可能不是中國人群GEFS+常見的致病基因。 4. SCN1A基因突變的位置與GEFS+I臨床發(fā)作類型和藥物效果有關。鈉通道α亞單位跨膜片段s6錯義突變引起全面性發(fā)作,丙戊酸鈉治療有效。鈉通道a亞單位S5-S6連接環(huán)錯義突引起部分性發(fā)作,奧卡西平治療無效,左乙拉西坦有效。對指導臨床治療有重要的實用意義。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1;R720.597

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