本文關(guān)鍵詞：p66Shc特異性慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)高氧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響

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【摘要】：目的：構(gòu)建p66Shc特異性慢病毒載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞中，抑制p66Shc的表達(dá)，并探討其對(duì)高氧誘導(dǎo)肺泡上細(xì)胞凋亡的影響。 方法：設(shè)計(jì)3條p66ShcRNA干擾靶點(diǎn)，合成雙鏈DNA，與雙酶切后的慢病毒空載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的細(xì)胞，鑒定陽(yáng)性克隆正確后，抽提、擴(kuò)增質(zhì)粒，與另外3個(gè)輔助包裝質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝，測(cè)定滴度后感染A549細(xì)胞，，選取沉默效應(yīng)最為明顯的p66Shc-Shc1組進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，穩(wěn)定培養(yǎng)一個(gè)月。同時(shí)體外傳代培養(yǎng)慢病毒空載體感染的A549細(xì)胞及未做任何處理的A549細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為四組：對(duì)照組，高氧組，慢病毒+高氧組，空載體+高氧組。對(duì)照組：在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；高氧組、慢病毒+高氧組、空載體+高氧組：加入等量的上述培養(yǎng)液，換液后，以3L/min的速度通入含95%氧氣的高純混合氣10min，后在培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo):倒置相差顯微鏡下觀察A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高氧及慢病毒載體對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；SP細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)分組24小時(shí)后XIAP，Caspase-9蛋白的表達(dá)；激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體活性氧產(chǎn)生情況及膜電位變化情況。 結(jié)果：（1）p66Shc-pLenR-GPH載體的鑒定：將重組質(zhì)粒及pLenR-GPH空載體以限制性內(nèi)切酶雙酶切后行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果與預(yù)期相符，LV-shRNA載體構(gòu)建成功。（2）慢病毒的包裝：將所構(gòu)建的p66Shc-pLenR-GPH重組質(zhì)粒及pLenR-GPH空載體與輔助包裝質(zhì)粒pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染終止24小時(shí)后在熒光倒置顯微鏡下觀察，每孔細(xì)胞均表達(dá)GFP綠色熒光，轉(zhuǎn)染成功。（3）穩(wěn)定沉默p66Shc基因的A549細(xì)胞系的建立：將濃縮后的病毒感染A549細(xì)胞，對(duì)感染后的A549細(xì)胞做熒光定量PCR及Western blot，3組細(xì)胞p66ShcRNA表達(dá)量降低，p66Shc蛋白的表達(dá)下降，p66Shc-Shc1組下降更為明顯，表明我們已經(jīng)成功建立了穩(wěn)定沉默p66Shc的A549細(xì)胞系，并選取p66Shc-Shc1組進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（4）倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變:對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好，呈鋪路石樣，為典型扁圓多角形，數(shù)量多，排列緊密，懸浮細(xì)胞少。高氧組及空載體+高氧組細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞數(shù)量增多，貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞形態(tài)由典型的扁圓多角形變成圓形或橢圓形，數(shù)量減少，連接松散，細(xì)胞間隙可見較多細(xì)胞碎片。慢病毒+高氧組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳，部分細(xì)胞形態(tài)由典型的扁圓多角形變成圓形或橢圓形，活細(xì)胞數(shù)量較高氧組增多，懸浮細(xì)胞數(shù)量較高氧組少，但未達(dá)到對(duì)照組水平；（5）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡:與對(duì)照組相比，高氧組及空載體+高氧組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。而慢病毒+高氧組的凋亡率有所降低，與高氧組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；（6）免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)：與對(duì)照組相比，高氧組及空載體+高氧組細(xì)胞內(nèi)XIAP表達(dá)減少，Caspase-9蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。而與高氧組相比，慢病毒+高氧組細(xì)胞內(nèi)XIAP表達(dá)增加，Caspase-9蛋白的表達(dá)有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；（7）激光共聚焦顯微鏡結(jié)果：與對(duì)照組相比，高氧組細(xì)胞線粒體活性氧含量顯著增加，膜電位明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。而與高氧組相比，慢病毒+高氧組細(xì)胞線粒體活性氧含量顯著減少，膜電位明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)，但未達(dá)到對(duì)照組水平(p0.05)。 結(jié)論：高氧誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p66Shc出現(xiàn)高表達(dá)，發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)位于線粒體，線粒體活性氧產(chǎn)生增多，膜電位下降。靶向表達(dá)p66Shc的shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染入人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞內(nèi)，可通過RNA干擾導(dǎo)致p66Shc基因沉默，減少線粒體活性氧產(chǎn)生，減輕膜電位下降，減少A549細(xì)胞凋亡，減輕肺泡上皮細(xì)胞的損傷。而慢病毒空載體組則沒有這種變化。
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R722.6

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 車忠麗;董文斌;李清平;雷小平;康蘭;郭琳;翟雪松;陳楓;;PKCβ/p66Shc氧化應(yīng)激通路介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡的作用[J];臨床兒科雜志;2013年11期

本文編號(hào)：1298370