發(fā)布時間：2017-12-12 17:10

  本文關(guān)鍵詞：抗EV71單克隆抗體的中和保護作用及機制研究

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【摘要】：腸道病毒71型（Enterovirus71， EV71）是手足口病最常見的病原體之一，能引起以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、皰疹為主要特征的急性傳染病，感染以嬰幼兒多見[1]，尤其在亞太地區(qū)具有明顯的發(fā)病率和致死率，僅2008年到2012年中國大陸地區(qū)多次暴發(fā)手足口病，死亡超過2000例，成為嚴重危及公共健康的問題[2]。EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬[3]，其基因組由一條正鏈單股RNA組成，含有7408個核苷酸，病毒顆粒直徑約300，是一個對稱的二十面立體球形結(jié)構(gòu)，包含60個由VP1~4四種蛋白拼裝的五聚體亞單位，VP1~3三種蛋白各自形成三明治折疊結(jié)構(gòu)相互連接暴露在病毒顆粒的表面，VP4蛋白包埋在病毒衣殼內(nèi)[4,5]。 目前EV71感染的防治工作面臨著很多問題，致病機制和流行趨勢尚不明確，臨床上既無有效疫苗用于預(yù)防感染，又無有效的抗病毒藥物用于治療，疫情在很長時間內(nèi)難以得到緩解�；谶@種現(xiàn)狀，研制抗EV71保護性抗體的策略得到了廣泛地關(guān)注。盡管目前已有研究發(fā)現(xiàn)幾株抗EV71中和性抗體及中和表位，但保護機制和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)依然未知。 本研究利用EV71病毒及其衣殼蛋白聯(lián)合免疫小鼠，篩選得到14株抗EV71單克隆抗體。ELISA檢測了14株雜交瘤細胞上清與EV71病毒滅活疫苗的相對結(jié)合力。保護實驗證明，14濃縮抗體上清中7株對抑制EV71導(dǎo)致的細胞病變有比較明顯的抑制作用，我們進一步將這7株細胞株腹腔注射制備鼠源性抗體并純化。體外細胞保護試驗證明有4株鼠源性單克隆抗體可以有效的降低EV71對RD細胞的侵染，在100ug/ml的濃度時，單抗2G12和12B6能保護60%以上的細胞免于病變。病毒空斑試驗進一步驗證了這4株單抗對細胞的保護作用。免疫印跡發(fā)現(xiàn)7株單抗中有3株均不結(jié)合變性狀態(tài)下的病毒的重組VP1蛋白，提示這3株抗體識別的可能是空間表位。其余4株抗體均可識別VP1上的線性表位。 為明確中和性抗體2G12的作用表位，我們利用噬菌體展示隨機十二肽庫對2G12進行了表位淘選，篩到一段結(jié)合位點215KQEKD219，，進一步合成表位肽P2可與2G12特異性結(jié)合，并且能夠競爭性阻斷2G12與EV71的結(jié)合。 抗體2G12的中和表位位于EV71外殼蛋白VP1的GH loop區(qū)域，有研究表明VP1的GH loop在病毒脫殼構(gòu)象改變過程中發(fā)揮著重要作用。為進一步研究2G12中和性抗體的作用機制，我們?nèi)蚝铣刹⒈磉_了EV71細胞受體SCARB2胞外段蛋白。通過ELISA驗證了SCARB2胞外段的結(jié)合活性，SCARB2可與EV71、VP1蛋白結(jié)合，且結(jié)合不受抗體2G12的影響。我們進一步將不同條件下病毒感染的細胞采用RT-PCR進行檢測，通過計算病毒RNA相對拷貝量我們發(fā)現(xiàn)，保護性單抗2G12并不能阻斷病毒與受體的結(jié)合而是影響了病毒入侵的脫顆粒過程，從而抑制了病毒對細胞的侵染。因此，我們認為中和抗體2G12是通過影響了病毒脫顆粒的關(guān)鍵功能域GH LOOP的構(gòu)象改變，進而阻礙了病毒RNA釋放進入細胞內(nèi)質(zhì)，保護宿主細胞免受病毒感染。 本課題篩選獲得了四株有效的抗EV71單克隆抗體，鑒定了1株強中和保護抗體的識別表位，并首次從病毒脫顆粒的角度上闡述了2G12單克隆抗體的中和保護機制。為進一步抗體藥物的研究和防治EV71感染流行奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R725.1

【共引文獻】

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4 曾洪武;黃文獻;林飛飛;謝娜;陸普選;干蕓根;;EV71型手足口病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥急性期影像表現(xiàn)分析[J];中國CT和MRI雜志;2013年04期

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6 利漢其;廖友明;白翠芬;;重癥手足口病嬰幼兒分級治療的療效觀察[J];廣東醫(yī)學(xué);2013年23期

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8 盧美君;朱朝敏;;重癥手足口病心血管系統(tǒng)損害及診治進展[J];兒科藥學(xué)雜志;2014年02期

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10 楊德華;易冬玲;譚鈞元;周曉飛;藍英;張朝勇;張亦維;龍露萍;李繼科;;西部某醫(yī)院484例重型手足口病臨床特點分析[J];傳染病信息;2014年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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2 Huanying Zheng;陸靖;Yong Zhang;Hiromu Yoshida;Xue Guo;Leng Liu;Hui Li;Hanri Zeng;Ling Fang;Yanling Mo;Lina Yi;Toru Chosa;Wenbo Xu;Changwen Ke;;Prevalence of Nonpolio Enteroviruses in the Sewage of Guangzhou City,China,from 2009 to 2012[A];廣東省預(yù)防醫(yī)學(xué)會優(yōu)秀論文集[C];2014年

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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6 王曉雯;高致病小RNA病毒病毒樣顆粒的制備及部分顆粒的免疫研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2013年

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8 李華軍;抗菌肽對變形鏈球菌作用機制以及MurA靶點的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

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10 陳豪泰;口蹄疫基因工程病毒拯救及其舌下免疫研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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6 劉雯;2008-2010年開封市手足口病流行狀況分析[D];鄭州大學(xué);2012年

7 袁曉晶;腸道病毒71型分離鑒定及其致病機制的初步探討[D];山東大學(xué);2013年

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本文編號：1283280