本文關(guān)鍵詞：MLPA技術(shù)檢測矮小兒童GH受體及信號通路相關(guān)基因的研究

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【摘要】：研究背景： 身材矮小(short stature)是指在相似環(huán)境下,兒童(或成人)的身高較正常的同種族、同年齡、同性別的人群身高均值低2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(-2SD)以上或處于第3百分位以下。目前矮小癥的主要病因分為兩大類,垂體性疾病(如生長激素缺乏癥、生長激素分泌障礙、多種垂體激素缺乏癥、顱內(nèi)腺瘤)和非垂體性疾病,非垂體性疾病又可分為特發(fā)性矮小、家族性矮小、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、青春期發(fā)育遲滯、營養(yǎng)不良及微量元素疾病(如鋅缺乏、鉛中毒)、非垂體性內(nèi)分泌疾病、遺傳代謝性疾病、全身疾病等。在矮小癥病因中,居前兩位的高頻病因?yàn)樯L激素缺乏及特發(fā)性矮小。 生長激素(growth hormone GH)是一種由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的由191個(gè)氨基酸組成的單鏈親水球蛋白,具有促進(jìn)生長,調(diào)節(jié)骨代謝及物質(zhì)代謝等作用,是人體生長不可缺乏的成分。生長激素的合成和分泌受下丘腦生長激素釋放激素和生長激素釋放抑制激素的雙重控制。生長激素缺乏癥(growth hormone deficiency GHD)是指垂體前葉生長激素缺乏或分泌不足所致的生長障礙,可分為單純性生長激素缺乏或伴多種垂體激素缺乏。 特發(fā)性矮小(idiopathic short stature, ISS)是一種暫時(shí)尚無明確原因的矮身材,可能是一種多基因疾病,臨床上無GH缺乏和明顯的進(jìn)行性病理改變,可能包括GH不敏感、(normal variant short stature)、GH神經(jīng)分泌功能紊亂(growth hormone neurosecretory dysfunction GHND)、特發(fā)性生長障礙和非GHD性身材矮小等。ISS是兒童矮小癥的常見類型,ISS患兒出生體重和生長激素分泌正常,其發(fā)病率在矮小兒童中約占60%-80%。 生長激素主要通過以下方式起作用：1、與生長激素受體(GHR)結(jié)合直接發(fā)揮作用；2、與GHR結(jié)合啟動(dòng)STAT (STAT1, STAT3, STAT5A, STAT5B)或MAPK或PI3K-AKT等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而刺激胰島素樣生長因子(IGF)分泌,以達(dá)到促進(jìn)生長及調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的作用,即GH-IGF軸。酪氨酸激酶一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)途經(jīng)是GHR的重要信號通路,GH與GHR結(jié)合后主要激活JAK家族中的JAK2。編碼JAK2的基因在9號染色體(9p24)。STAT是另一個(gè)重要的信號通路分子,STAT的活化需要GHR和JAK2分子上一些特異的區(qū)域,需要JAK2和GHR胞漿區(qū)的相互作用。STAT5b是人類生長發(fā)育最密切的通路分子,其基因位于17q21.2,含有19個(gè)外顯子。 促絲裂素原激活的蛋白激酶(MAPK)是生長激素的另一條重要的信號通路,其激活方式是一個(gè)三級激酶模式,包括MAPK激酶激酶(MAP kinase kinase kinase, MKKK). MAPK激酶(MAP kinase kinase, MKK)和MAPK,這三種激酶能依次激活,共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長、分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理／病理過程。生長激素受體還可以激活PI3K-AKT通路,首先PI3K在已激活的生長激素受體的作用下激活并在細(xì)胞膜產(chǎn)生3,4二磷酸磷脂酰肌醇和3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇,AKT在二磷酸磷脂酰肌醇的作用下產(chǎn)生同二聚體并達(dá)到部分激活的狀態(tài),而二聚體進(jìn)一步增強(qiáng)了AKT的活性,最后活化的AKT隨后由細(xì)胞膜上釋放下來,使其得以到細(xì)胞漿內(nèi)繼續(xù)傳遞生物學(xué)信號用。 對于身材矮小的基因研究多數(shù)研究者選擇直接測序法,但矮小的病因繁多,且一種病因所涉及的基因片段也高達(dá)數(shù)十甚至上百個(gè)。選擇直接測序法不僅經(jīng)濟(jì)上花費(fèi)巨大,人力物力也是不小的支出,且對于大片段的基因雜合缺失可能不表現(xiàn)出異常結(jié)果。 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiple ligation-dependent probe amplification MLPA)技術(shù)是2002年由荷蘭的Schouten等發(fā)明的一種建立在DNA探針雜交和PCR技術(shù)上的針對待測核酸中靶序列進(jìn)行定性和半定量的高通量分析技術(shù)。MLPA技術(shù)僅需少量的DNA,主要通過變性、雜交、連接和擴(kuò)增等四個(gè)過程,在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測高達(dá)40多個(gè)核苷酸序列拷貝數(shù)變化,并進(jìn)行定量分析檢測。可根據(jù)MLPA圖信號值的改變判斷靶序列是否有點(diǎn)突變或拷貝數(shù)的異常。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Realtime fluorescent quantitative PCR)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)通過熒光信號的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,使PCR擴(kuò)增和終產(chǎn)物檢測全部處在封閉的條件下進(jìn)行,從而具有實(shí)時(shí)監(jiān)測、無污染、快速、靈敏、精確、特異等特點(diǎn),極大的克服了原有PCR技術(shù)的不足。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用熒光定量PCR是用于驗(yàn)證MLPA的結(jié)果及試圖縮小異�；蚍秶�,為后期明確具體突變位點(diǎn)打下基礎(chǔ)。 研究目的及意義： 本課題采用荷蘭MRC-Holland公司提供的分析GH受體及信號通路相關(guān)基因的試劑盒(SALSA MLPA KIT P262),同時(shí)檢測特發(fā)性矮小(ISS)患兒、生長激素缺乏(GHD)患兒及正常對照兒童11個(gè)GH受體基因片段及35個(gè)GH受體后信號通路等基因片段,以了解身材矮小患兒GH受體及信號通路相關(guān)基因的缺失、重復(fù)及其點(diǎn)突變情況。對MLPA結(jié)果異常者進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測和家系調(diào)查。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法(試劑盒由美國DSL公司提供)測定血清胰島素樣生長因子(IGF-1)濃度,探討基因突變對IGF-1的影響。 研究方法： 對象：①選擇2012年3月-2013年3月至深圳市婦幼保健院就診的矮小兒童96例,年齡4-13歲,男52例、女44例,根據(jù)身高低于同性別同年齡均值-2～-3SD,排除其他疾病導(dǎo)致的身材矮小,根據(jù)生長激素激發(fā)試驗(yàn),GH峰值10ng/ml,為生長激素缺乏癥(GHD)組共67例、GH峰值10ng/mI為特發(fā)性矮小(ISS)組共29例,另選擇同期體檢的生長發(fā)育正常兒童23例作為正常對照,年齡4-13歲,男13例、女10例。GHD組、ISS組與對照組性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②對已診斷為特發(fā)性矮小且發(fā)現(xiàn)其MLPA結(jié)果異常2例同胞姐弟及1例女性患兒,進(jìn)行兩家系調(diào)查,分別收集其家庭成員12人及6人。測量指標(biāo)： 對所有研究對象均記錄其性別、年齡,出生體重、身長,測量清晨8點(diǎn)左右空腹身高、體重,對身材矮小患者行生長激素激發(fā)試驗(yàn)、甲狀腺功能、肝腎功能、微量元素、骨齡及頭顱核磁共振、染色體等檢查。標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)室檢測： MLPA基因檢測：采集所有研究對象的外周靜脈血3ml,枸櫞酸二鈉抗凝,常規(guī)苯酚氯仿法提取基因組DNA,應(yīng)用MRC-Holland公司的P262試劑盒,進(jìn)行DNA變性、探針雜交、連接反應(yīng)、擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析。 熒光定量PCR檢測：取MLPA結(jié)果異�；純杭敖】祵φ战M正常兒童外周血3ml,常規(guī)苯酚-氯仿法提取基因組DNA后進(jìn)行DNA結(jié)合染料SYBR Green I的方法進(jìn)行熒光定量PCR。所采用的熒光定量PCR試劑為ABI SybrGreen PCR Master Mix (2X),所采用的熒光定量PCR儀為ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀,在配制反應(yīng)混合液完成后,設(shè)定PCR循環(huán)條件,進(jìn)行PCR循環(huán)。制作內(nèi)參基因、標(biāo)本基因擴(kuò)增曲線及溶解曲線,計(jì)算Ct值、2-(ΔΔCt)。 血清IGF-1測定：采集所有研究對象的外周靜脈血3ml,分離血清后,使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定IGF-1濃度,操作按說明書,批內(nèi)、批問變異系數(shù)達(dá)要求范圍。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確定樣本的群體代表性。計(jì)數(shù)資料采用R×C表χ2檢驗(yàn),理論頻數(shù)5時(shí)采用Fisher精確概率法,計(jì)量資料以x±s表示,多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、MLPA技術(shù)檢測身材矮小兒童GH受體基因情況： 所有研究對象的GHR基因外顯子(Ex)1～10均未發(fā)現(xiàn)信號升高,Ex1、2和4-10也未發(fā)現(xiàn)信號降低或缺失等異常情況；GHR外顯子3位于MLPA圖譜第30個(gè)基因擴(kuò)增峰,其信號降低和完全缺失的發(fā)生率分別在GHD組為34.3%、1.5%,ISS組為17.2%、3.4%,對照組為26.1%、8.7%。三組兒童GHR基因Ex3基因型及等位基因頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均0.05。三種GHR Ex3基因型兒童血清IGF-1水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。 2、MLPA技術(shù)檢測身材矮小兒童GH受體后信號通路等基因突變情況： 所有研究對象的針對JAK2(1-7、9、2、14、16、19、21、23、25外顯子)、STAT5b(1-4、7、12、13、15、16、18、19外顯子)和IGF-1(1、3、4、6外顯子)的特異性探針檢測均未發(fā)現(xiàn)信號異常；STAT5b基因的第6外顯子5’端內(nèi)含子區(qū)域(后文簡寫為STAT5b Ex6)信號位于第36個(gè)基因擴(kuò)增峰,在ISS組有3例患兒此信號強(qiáng)度與正常人信號的比率小于0.6,為2例同胞姐弟及1例女性患兒,檢出率為10.34%(共3例),在GHD組及正常對照組均未發(fā)現(xiàn)該片段信號降低。 3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果： 對3例MLPA顯示STAT5b基因的第6外顯子信號異�；純杭罢φ战M兒童,進(jìn)行STAT5b基因的第6外顯子5’端內(nèi)含子區(qū)域的擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR,熒光定量PCR檢測結(jié)果提示患者DNA該區(qū)域的表達(dá)量為正常對照組表達(dá)量的0.395,低于參考標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值0.6,驗(yàn)證該基因?yàn)殡s合突變。 4、STAT5b EX6基因缺失家系調(diào)查： ①家系Ⅰ共有成員12名,其中7名成員(男3例,女4例)GHR Ex6基因型與先證者一致,有4例身高低于同性別同年齡均值-2SD、2例低于同性別同年齡均值、1例身高正常。 ②家系Ⅱ共有成員6名,其中3名成員(男2例,女1例)GHR Ex6基因型與先證者一致,有1例身高低于同性別同年齡均值-2SD、2例低于同性別同年齡均值。 結(jié)論： ①應(yīng)用MLPA技術(shù)檢測生長激素受體基因結(jié)果顯示GHD組、ISS組和正常對照組均發(fā)現(xiàn)有GHR基因外顯子3信號降低及完全缺失,三組兒童GHR基因Ex3基因型及等位基因頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各基因型的IGF-1水平也無明顯差異,考慮GHR基因外顯子3信號降低及完全缺失為基因在人群中的多態(tài)性分布。 ②應(yīng)用MLPA技術(shù)檢測生長激素受體后信號通路等基因結(jié)果示：特發(fā)性矮小患兒中發(fā)現(xiàn)編碼STAT5b蛋白的第6外顯子5’端存在基因缺失,而在生長激素缺乏癥和正常兒童中未發(fā)現(xiàn)。鑒于STAT5b基因純合突變可導(dǎo)致身材矮小,該基因雜合突變可能與患兒身高受損有關(guān)。 ③STAT5b Ex6基因雜合缺失家系調(diào)查：兩家系成員共18例,有10例STAT5b Ex6基因型與先證者一致,其中9例身高低于同年齡同性別均值(占90%),5例身高低于同年齡同性別均值-2SD(占50%)：10例中兒童4例(身高均低于同年齡同性別均值-2SD)、成人6例(5例身高均低于同年齡同性別均值,其中1例低于同年齡同性別均值-2SD；4例血IGF-1水平明顯低下),提示STAT5b Ex6基因雜合缺失對兒童身高和成人終身高以及成人IGF-1水平均有一定的影響,其生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R725.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1243690