本文關(guān)鍵詞：牛乳鐵蛋白對大鼠小腸空腸上皮細(xì)胞株的影響研究

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【摘要】：研究背景新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(neonatal necrotizing enterocolitis,NEC)是早產(chǎn)兒死亡的主要原因之一,是新生兒常見的消化道急癥之一,主要發(fā)生在早產(chǎn)兒,且胎齡越小,出生體重越低,發(fā)生率越高。腸壁囊樣積氣和門靜脈充氣征為X線特征,發(fā)病因素具有多源性,故其發(fā)病機(jī)制至今尚不明確,大多認(rèn)為與早產(chǎn)、喂養(yǎng)不當(dāng)、感染、腸道黏膜缺氧缺血及細(xì)菌異常種植等原因有關(guān),預(yù)防上也沒有明確的指南。NEC患者輕者可能出現(xiàn)嘔吐、腹脹,重者則可能出現(xiàn)嗜睡、體溫不穩(wěn)、休克或出現(xiàn)腹壁紅腫、腹腔積液,短期內(nèi)可引起多種嚴(yán)重的并發(fā)癥(如腸狹窄、腹膜炎等),會出現(xiàn)小頭畸形或嚴(yán)匝神經(jīng)發(fā)育問題,且重癥NEC有較高的致殘率[3-4]。我國出生體質(zhì)量1.5kg的嬰兒NEC發(fā)病率6%～10%,國內(nèi)病死率為10%～50%；美國出生體質(zhì)量1.5 kg嬰兒的發(fā)病率為5%～15%,病死率20%～30%。目前,臨床上主要根據(jù)臨床表現(xiàn)以及最常用的輔助檢查方法腹部X線片作為早期診斷NEC的方法,但此后者雖對于診斷NEC特異度較高,但對于疾病的早期診斷卻沒有太大意義。臨床中也可以通過B超發(fā)現(xiàn)門靜脈的起泡幫助NEC的早期這段,而且臨床中還有很多關(guān)于IL-8、IL-1以及IL-10受體拮抗劑或脂肪酸結(jié)合蛋白等生化指標(biāo)用于輔助診斷NEC的研究,但仍缺乏較好的用于早期診斷NEC的血生化指標(biāo)。新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎其重要的病理生理過程復(fù)雜,理論上任何影響腸道血流的因素都會增加NEC的發(fā)生,加之新生兒或早產(chǎn)兒胃腸道功能的不完善,加之外界環(huán)境的改變感染,導(dǎo)致腸腔內(nèi)細(xì)菌以及內(nèi)毒素等由上皮細(xì)胞間隙進(jìn)入人體造成局部組織或全身炎癥反應(yīng)。腸上皮細(xì)胞作為直接接觸外界腸道微環(huán)境的細(xì)胞,對維持腸道功能具有不可替代的作用。腸道上皮細(xì)胞是維持腸道上皮通透性的執(zhí)行者,起著至關(guān)重要的作用,一方面其可以作為機(jī)械屏障非選擇性發(fā)揮抵御外來生物體及有毒物質(zhì)進(jìn)入人體的作用,另外一方面其可以特異性選擇準(zhǔn)許小分子物質(zhì)、離子進(jìn)入通過腸道上皮屏障,而將抗原大分子、外界的病原微生物等阻礙在屏障之外。許多研究都顯示NEC的發(fā)病機(jī)制中腸道上皮細(xì)胞起著重要的作用。腸道作為人體重要的免疫器官,人體有80%的免疫細(xì)胞存在于腸道中,當(dāng)NEC發(fā)生時(shí),NEC會產(chǎn)生大量的炎癥因子以及相關(guān)細(xì)胞因子,從而加重了腸道粘膜的損傷,同時(shí)也會造成其他重要器官,如腦的損傷。因此有許多研究都嘗試通過口服抗生素來減少致病因素的發(fā)生,但口服抗生素同時(shí)會影響腸道正常菌群的建立,尤其是對于新生兒來說,正常腸道菌群對于維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)相比較于己經(jīng)有一定免疫能力的成年人來說更是重要得多,因此目前已很少采用服用口服抗生素來預(yù)防NEC的發(fā)生。與此同時(shí),近些年益生菌預(yù)防NEC的研究也很火熱。直至Mori等人通過回顧性的研究分析了日本大阪1982至2006年NICU的NEC發(fā)生率與臨床治療策略的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)、使用益生菌和避免臍靜脈置管是降低NEC發(fā)生的主要原因。乳鐵蛋白作為母乳中重要的蛋白成分,已被證實(shí)具有光譜的抗炎、抗氧化等對新生兒保護(hù)的作用,但由于人乳鐵蛋白具有原料昂貴的特點(diǎn),商品話存在一定的限制。牛乳鐵蛋白具有與人乳鐵蛋白70%以上的同源序列,且我國可利用牛乳加工奶酪時(shí)的副產(chǎn)物乳清進(jìn)行加工提取牛乳鐵蛋白,所以相對于從人乳中提取乳鐵蛋白,利用牛乳生產(chǎn)商業(yè)化的牛乳鐵蛋白原料極為豐富。綜上所述,本研究擬從臨床新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎病理生理過程為切入點(diǎn),利用腸道上皮細(xì)胞模擬體外細(xì)胞炎癥模型,以此評價(jià)牛乳鐵蛋白對腸上皮細(xì)胞的影響,尤其是在炎癥模型下抗炎的作用,為天然藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。目的1.探究牛乳鐵蛋白對IEC-6細(xì)胞細(xì)胞活性的影響：2.研究牛乳鐵蛋白對IEC-6細(xì)胞增殖能力的影響及機(jī)制；3.探討牛乳鐵蛋白在LPS體外誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞炎癥模型下對細(xì)胞炎癥的影響及機(jī)制。方法1.細(xì)胞活性的檢測MTT法檢測bLF對IEC-6細(xì)胞線粒體活性的影響,MTT全稱為3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,,是一種黃顏色的染料,活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO),俗稱萬能溶劑,能溶解細(xì)胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測儀特定波長處測定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞內(nèi)線粒體的活性成正比。本實(shí)驗(yàn)通過比較牛乳鐵蛋白處理與非處理組其吸光吸收值來比較細(xì)胞活性的變化。2.細(xì)胞增殖能力的檢測Brdu,即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷,為細(xì)胞有絲分裂所必須需胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),用BrdU預(yù)處理的細(xì)胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的DNA雙鏈中,而且這種置換可以穩(wěn)定存在,并帶到子代細(xì)胞中。細(xì)胞經(jīng)過固定和變性處理后,可用免疫學(xué)方法檢測DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗標(biāo)記,最后用比色法或熒光的方法進(jìn)行定量測定),從而判斷細(xì)胞的增殖能力。3.流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期的檢測細(xì)胞在增殖過程中,首先會發(fā)生DNA的復(fù)制,通過將熒光標(biāo)記的碘化丙啶PI插入到DNA雙鏈中,可以通過插入量來評價(jià)細(xì)胞內(nèi)DNA含量,后通過流式細(xì)胞術(shù)來檢測每個(gè)細(xì)胞中標(biāo)記的熒光來評估細(xì)胞所處的細(xì)胞分裂時(shí)間段。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)就是指在普通PCR的反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),從而利用熒光信號累計(jì)來檢測整個(gè)PCR過程,最后通過擴(kuò)增曲線來檢測特異靶基因的mRNA表達(dá)水平。在本實(shí)驗(yàn)中通過比較在LPS刺激下,相關(guān)細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β)在IEC-6細(xì)胞中mRNA水平,從而評價(jià)bLF對抗炎癥的效應(yīng)。5. ELISA細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的檢測ELISA,即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),其原始是使抗原或抗體結(jié)合到96孔板固相載體表面,并在有效期內(nèi)保持其免疫活性,后用使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時(shí),把受檢標(biāo)本(本實(shí)驗(yàn)中為細(xì)胞培養(yǎng)上清)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可極大地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。通過用bLF(預(yù))處理IEC-6細(xì)胞,或同時(shí)用LPS刺激IEC-6細(xì)胞,用商業(yè)化的ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-8、IL-6以及TNF-α的含量。6. Western blot檢測信號通路激活及抑制情況MAKP,即絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一種能被不同的細(xì)胞刺激因子刺激,如細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、激素、炎癥等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。所有真核細(xì)胞都能表達(dá)MAPK,其與MKKK、MKK、共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、對環(huán)境應(yīng)激的適應(yīng)以及炎癥反饋等過程。NF-κB,是細(xì)胞自身防御、損傷應(yīng)激、細(xì)胞分化和凋亡過程中重要的信息傳遞者。作為MAPK重要的下游分子,NF-κB是細(xì)胞多種損傷反應(yīng)基因的調(diào)節(jié)因子,有大量的研究已經(jīng)報(bào)道在靜息狀態(tài)下,NF-κB常與其抑制性蛋白I-κB蛋白結(jié)合并穩(wěn)定存在于細(xì)胞胞漿中,p38被激活后可磷酸化I-κ B,進(jìn)而I-κ B被降解,從而與NF-κB解聚,解聚后的NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位,繼而與DNA接觸,啟動或抑制有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。通過比較bLF(預(yù))處理IEC-6細(xì)胞后,LPS誘導(dǎo)的MAPK信號通路激活情況探究bLF抗炎的分子機(jī)制。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)比較用GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),后多重比較組間差異用Newman Keuls方法,當(dāng)P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.bLF可顯著提高IEC-6細(xì)胞的細(xì)胞活性；2.bLF通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期來促進(jìn)IEC-6細(xì)胞增殖；3.bLF通過抑制LPS誘導(dǎo)的MAPK磷酸化激活,從而抑制NF-κB核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)IEC-6炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)。結(jié)論牛乳乳鐵蛋白可促進(jìn)大鼠小腸上皮隱窩細(xì)胞株IEC-6的細(xì)胞活性及增殖能力,在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中,牛乳鐵蛋白可通過抑制MAPK磷酸化抑制NF-κB激活及核轉(zhuǎn)位,從而抑制IEC-6相關(guān)細(xì)胞炎癥因子的細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)和細(xì)胞外分泌起到抗炎癥效應(yīng),牛乳鐵蛋白可能在未來治療新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R722.1

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本文編號：1160632